猪精液冷冻保存的剂型及品种效应

为了评价细管类型在不同品种公猪精液冷冻中的效果,为猪精液冷冻的实际生产中冷冻细管的选择提供理论依据,试验将长白、大约克与杜洛克3种美系公猪(每品种7头次)精液进行不同细管类型(5.00、0.50、0.25 mL)的分装冷冻,比较各种细管类型下不同品种公猪之间和同一品种公猪不同细管类型精液冻后质量(冻后精子活力、畸形率及顶体完整率).结果表明,①相同剂型下,除了0.25 mL细管分装时杜洛克公猪冻后精子顶体完整率显著(P＜0.05)高于长白公猪外,3种公猪之间在3个指标上差异均不显著(P＞0.05);②3种公猪冻后精子活力最高的剂型均为0.50 mL细管,冻后精子畸形率及顶体完整率最好的剂型均为5.00 mL细管.总之,3种细管类型中,仅0.25 mL剂型存在品种效应,而3个品种公猪却存在着基本类似的剂型效应.     

影响猪精子耐冻性的候选基因分析

在对通城猪精液冷冻保存的过程中,发现精液冻存质量存在个体差异。根据多次精液冻存后的精子活力检测结果,结合系谱关系筛选出精子耐冻与不耐冻个体各3头,并采用“中芯一号”SNP芯片进行群体遗传分化指数（FST）分析,应用生物信息学方法挖掘影响猪精子耐冻性差异的关键候选基因。结果显示：22头通城猪精液冻存后的精子活力存在明显差异,3头精子耐冻个体之间和3头精子不耐冻个体之间分别具有更近的亲缘关系,表明猪精子耐冻性差异可能受遗传因素影响;对耐冻性差异个体SNP芯片数据的FST分析结果显示,FST平均值为0.170 5,存在较高程度的遗传分化;进一步选取FST前1%（FST＞0.53）的266个SNP位点,并在其上下游100 kb区域共注释到了397个候选基因,富集在细胞形态、肌动蛋白细胞骨架和离子通道等生物学过程;其中KCNG4、ARPC1B、DNAAF4、MNS1、LIMK2、RPL31和VIM等基因可作为猪精子耐冻性差异的关键候选基因。以上结果说明,猪精子耐冻性受遗传因素影响,并受到关键基因控制,值得进一步对其基因功能进行研究。     

不同抗冻保护剂对鸡精液冷冻效果及基因表达的影响

旨在研究不同抗冻保护剂对鸡精液的冷冻保存效果,并通过比较差异表达基因,以解释不同保护剂的抗冻机制。以海兰褐种公鸡为研究对象,检测了不同抗冻保护剂(保护剂Ⅰ和保护剂Ⅱ)冷冻保存后的精子活性,并利用Affymetrix表达谱芯片检测技术,对差异表达相关基因进行筛选。结果表明:1)保护剂Ⅰ组的精液冻后活力活率(27.05±1.22vs 47.65±5.89)显著高于保护剂Ⅱ组(20.65±1.50vs 35.15±5.15)(P0.05);2)鸡精液冷冻后,2个不同抗冻保护剂处理组共发现1 604个差异表达基因。保护剂Ⅰ组中显著上调的基因1 380个,显著下调的基因224个;3)基因本体(GO)分析表明,包括核糖体亚基、线粒体呼吸链、泛素蛋白连接酶结合和微管蛋白结合,翻译起始以及RNA分解代谢等过程都与精液抗冻性相关;4)KEGG通路富集分析发现,其主要富集在内质网应激通路、氧化磷酸化、蛋白质泛素化、核糖体调控以及线粒体呼吸调控等相关信号通路上;5)挑选CCND1、HSP70、RHOA、HSP90和CIRBP5个差异表达基因并利用荧光定量PCR对芯片结果进行验证,二者吻合。综上,初步研究比较了2种精液保护剂的冷冻效果,并筛选出差异表达基因,发现抗冻保护剂Ⅰ更适合海兰褐种公鸡冷冻精液的保存,为鸡精液冷冻技术提供参考,并为鸡精液抗冻分子机制解析提供方向。     

辽宁：雪龙黑牛产业注入新活力

近日，雪龙黑牛股份有限公司与内蒙古赛科星繁育生物技术股份有限公司合作，签署了“雪龙黑牛精子分离——性控冻精生产技术研究开发及相关技术服务合作协议”。研究开发雪龙黑牛冷冻精液性控技术，推广雪龙黑牛冷冻精液的应用范围。该项目计划年产性控精液7万支，将广泛使用于雪龙公司在辽宁、山东等地的繁育基地。     

HSP90蛋白表达量与牛精子抗冻性的关系

【目的】探索热应激蛋白90（HSP90）表达量与牛精液冷冻-解冻后品质的关系。【方法】采用假阴道法采集身体健康、年龄2～4岁的9头荷斯坦奶牛精液（编号1～9）,测定新鲜精液指标（活力、形态、活率和密度）,评定其品质,合格的精液样品经过冷冻解冻后检测其精子活率、质膜完整率和顶体完整率,并根据冻后品质将其分为HFTs(High freezing resistance teams)和LFTs（Low freezing resistance teams) 2组,对精子HSP90蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳和Western blot检测,分析其表达量与精子抗冻性的关系。【结果】不同牛个体精液冻后品质相差较大。SDS-PAGE电泳结果显示,HFTs组的分子质量约为90 ku的蛋白表达量显著高于LFTs组（P＜0.05）,经Western blot分析,该蛋白为HSP90。HSP90蛋白表达量与冷冻-解冻后的牛精子品质呈明显正相关,其与精子活率、顶体完整率、质膜完整率的相关系数分别为0.364,0.447和0.402。【结论】HSP90蛋白表达量可以作为判断牛精子抗冻性的指标之一。     

中药提取物川芎嗪及葛根素在猪精液冷冻中的应用效果初报

为了进一步提高猪精液的冻后品质,为中药提取物在猪精液冷冻中的应用提供参考数据,采用手握法采集成年种公猪精液,预处理后用添加不同剂量盐酸川穹嗪(0、0.08、0.10、0.12 mmol/L)和葛根素(0、0.001、0.01、0.10 mmol/L)的稀释液稀释,经平衡、冷冻、解冻后采用考马斯亮蓝对精子进行染色,然后在显微镜下检查精子畸形率和顶体完整率。结果表明,不同浓度的盐酸川穹嗪均能显著降低冻后精子的畸形率,显著提高冻后精子的顶体完整率,其中0.12 mmol/L盐酸川穹嗪效果最好。一定量葛根素不能显著降低冻后精子的畸形率,也不能显著提高冻后精子的顶体完整率。     

提高种公猪生产性能的综合管理措施

良好的饲养管理是保证种公猪优良繁殖性能的基础条件,饲养管理的实践应着眼于种公猪繁殖性能的充分表现,从经济上讲,就是通过加强饲养管理以保证种公猪良好的体况、正常的性机能、提高精子的产量和质量。本文从以下几个方面综述了如何提高种公猪生产性能。饲料营养营养是维持种公猪正常生命活动、产生精子和保持旺盛配种能力的基础。因此,喂给营养价值完全的日粮,可增进种公猪的健康并提高其生精配种能力。1蛋白质与能量水平日粮中的蛋白水平对种公猪精液的多少和质量的高低以及精子寿命都有很大影响。种公猪精液中干物质占5%,其中蛋白质(3.…     

冷休克和冷冻对猪精子微细结构和精清内酶的影响

用9头梅山、8头二花脸和4头苏白公猪的精液进行了冷休克和冷冻试验.共分原精(对照)、稀释、稀释后平衡和冷冻四种情况,10个处理组别。结果表明,冷休克使猪精于活力明显下降,并随着低温处理的延长和冷冻过程而加剧.冷休克后光镜下顶体形态主要表现为质膜膨大,顶脊突出或形成皱褶。稀释后平衡有保护顶体减轻冷休克损伤的迹象.冻后精子主要表现为顶体严重肿胀,起泡乃至破裂.原精的顶体完整率与活力呈正相关(r=0.60,p<0.01),低温处理后这两个性状的相关不显著。猪精子冷冻前后的电镜观察研究揭示,解冻后精子的主要损伤部位在顶体.冻后精子质膜严重膨大、破裂,顶体外膜肿胀,形成小泡,顶体內容散失.试验中未见到由质膜和顶体外膜共同形成的所谓“杂合泡”。冷休克和冷冻后精清内 GOT 和 LDH 活性增加,冻后精清內 LDH 为原精的1.5倍,GOT 为原精的13.6倍。低温处理对精清内 GPT 活性的影响不大。用琼脂糖凝胶电泳分离猪精清,得到5条 LDH 同功酶区带.原精冷休克后 LDH—4上升(p<0.05),解冻后精清內 LDH—4上升(p<0.01),原精经稀释平衡后,M—LDH明显升高。     

实时精子分离系统对猪精子冷冻品质的影响

【目的】探索实时精子分离系统对猪精子冷冻品质的影响。【方法】采用实时精子分离系统对精液进行分离优选,液氮冷冻法制作细管冻精,以未分离精液为对照,检测实时精子分离系统对猪精子冷冻品质的影响。【结果】分离优选精子解冻后,精子活率、顶体完整率、质膜完整率、正常染色质率均明显高于对照组(P<0.01);分离组精子的正常形态率也显著高于对照组,且未受冷冻-解冻过程的影响(P>0.01);分离过程对精子密度也未产生显著影响(P>0.01)。【结论】实时精子分离系统可以显著改善猪冷冻精液的品质。     

猪精液颗粒冷冻技术的研究

为提高猪冻精质量,加速猪冻精在生产上的应用,本试验以解冻后的精子活率、顶体完整率和体外受精(IVF)结果作为判定指标,探讨了冷源和Equex.STM对猪精液颗粒冷冻效果的影响。手握法采集成年、健康种公猪精液,分别采用含有Equex.STM的稀释液和普通稀释液进行两步法稀释,然后以干冰或液氮为冷源进行精液冷冻。结果表明,以干冰为冷源滴冻精液冻后活率为0.487833±0.046761,顶体完整率为0.782±0.039704,而以液氮为冷源的方法冻后活率为0.3334±0.055734、顶体完整率为0.5578±0.068482,前者在这两项指标上均显著优于后者(P<0.05)。另外,在稀释液中添加Equex.STM,以干冰为冷源进行滴冻,可使冻精顶体完整率极显著提高(P<0.01)。以含有Equex.STM的稀释液采用干冰滴冻的冻精进行IVF,胚胎卵裂率、囊胚率分别为0.5316±0.125582和0.216±0.053198。结果表明,采用Equex.STM作为冷冻保护剂并以干冰作为冷源可以获得高质量的猪冷冻精子。     

高繁殖力和低繁殖力长白公猪的精子DFI差异分析

【目的】探究高繁殖力和低繁殖力长白公猪的精液品质及精子DNA损伤差异,为筛选出高繁殖力种公猪提供参考依据,进而优化猪场人工授精工作及提高种猪场的经济效益。【方法】选取12头法系长白公猪,通过分析繁育数据将其分组为高繁殖力和低繁殖力公猪,各6头;利用计算机辅助精子分析系统(CASA)对公猪精液品质参数进行检测分析,然后通过流式细胞仪检测精子DNA碎片指数(DFI)和活性氧(ROS)水平。【结果】高繁殖力公猪的平均窝产仔数和活产仔数均极显著高于低繁殖力公猪(P<0.01,下同),但二者的畸胎数和死胎数差异不显著(P>0.05,下同)。高繁殖力公猪精子的前进运动率显著高于低繁殖力公猪精子(P<0.05,下同),而精子畸形率极显著低于低繁殖力公猪,但二者在近端原生质滴率、远端原生质滴率及折尾率等方面的差异均不显著;除了高繁殖力公猪精子的曲线速率(VCL)显著高于低繁殖力公猪外,其他的运动参数均无显著差异;高繁殖力公猪的精子DFI和ROS水平均极显著低于低繁殖力公猪。长白公猪产仔数与各项精液质量参数的相关分析发现,公猪产仔数与精子DFI呈高度负相关(r=-0.85)、与精子畸形率(r=-0.70)和精子ROS水平(r=-0.78)呈中度负相关;公猪精子畸形率与精子DFI(r=0.63)和ROS水平(r=0.62)呈中度正相关;精子DFI和ROS水平呈高度正相关(r=0.93)。【结论】精子DNA碎片化与公猪繁殖力密切相关,即精子DFI可为评估公猪精液品质及繁殖力提供重要参考依据。因此,在筛选种公猪时精子DFI检测可作为公猪精子质量评估的补充手段,以协同人工授精技术提高受精率及猪场经济效益,进而推动养猪业的高质量发展。     

稀释液中卵黄浓度对猪精液冷冻保存效果的影响

为探索卵黄在猪精液冷冻中的应用效果,筛选出猪精液冷冻稀释液中卵黄的最佳浓度,分别在猪精液冷冻稀释液中添加不同比例（20%、25%、30%）的卵黄,并以精子活率、活力、路径速率（VAP）、轨迹速率（VCL）、直线运动速率（VSL）等为指标,对猪精液稀释后、平衡后和冷冻后3个阶段的精液质量进行比较分析。结果表明,将猪精液冷冻稀释液中卵黄的添加量提高5～10个百分点,其稀释后、平衡后及解冻后3个阶段精子的5个运动参数与常规添加量相比均无显著差异（P〉0.05）。可见,提高猪精液冷冻稀释液中卵黄浓度未能显著改善猪精液冷冻后的质量,综合考虑,猪精液冷冻稀释液中卵黄浓度仍以20%（v/v）为宜。     

猪精液0.5 ml细管快速冷冻和解冻方法的优化

 【目的】优化冷冻-解冻方法,提高0.5 ml细管快速冷冻保存猪精液的质量。【方法】冷冻方法：分别将细管水平置于液氮面上方3、5、7、9和11 cm处,每一水平位置细管分别熏蒸3、5、10、15和20 min后投入液氮保存,37℃×30 s水浴解冻,确定最优冷冻方法;在选择最优冷冻方法的基础上,分别采用37℃×30s(对照组)、42℃×25 s、47℃×20 s、52℃×15 s、57℃×10 s和62℃×5 s共6种方法水浴解冻,确定最佳解冻方法。【结果】采用3 cm×10 min冷冻方法,解冻0、8 h精液中精子活率、质膜完整率和顶体完整率均最高。采用相对“高温短时”解冻,精子活率、质膜完整率、顶体完整率和线粒体膜电位均较高,同时丙二醛浓度降低;57℃×10 s和62℃×5 s解冻的精子各项指标无显著差异（P＞0.05）,但前4项指标显著高于对照组（P＜0.05）,丙二醛浓度显著降低（P＜0.05）。【结论】优化猪精液0.5 ml细管快速冷冻的冷冻和解冻方法可以显著提高解冻质量,采用3 cm×10 min冷冻、57℃×10 s或62℃×5 s解冻方法效果最佳。     

猪精液冷冻保存的初步研究

采用液氮熏蒸法制作猪冻精颗粒 ,对稀释液及冷冻保护剂进行优化筛选。结果表明 ,在 5种稀释液中 ,5号稀释液优于其他 4种 (P<0 .0 5 ) ;甘油的冷冻保护性能优于乙二醇和二甲基亚砜 (P<0 .0 1) ,其适宜浓度为2 m L/ L;稀释液中添加安钠咖可有效延长精子的冻后存活时间 (P<0 .0 1)。猪精液冷冻效果的关键因素是冷冻温度、冷冻速度和解冻温度 ,通过对不同温度情况的研究 ,初步制定了猪精液冷冻温度曲线。     

干旱胁迫下两个玉米自交系雄穗花器官分化期的转录组分析

【目的】 运用现代分子生物学及高通量测序技术,在全基因组水平鉴定耐旱相关的基因,研究玉米雄穗花器官分化期对干旱胁迫的响应机理, 为抗旱育种将提供新的理论基础。【方法】 以干旱胁迫15 d和正常浇水的耐旱自交系“PHBA6”和干旱敏感自交系“吉63” 花器官分化期的雄穗进行Illumina HiSeq 2000高通量测序分析,将测序得到的Unigene与玉米参考基因组进行比对,利用 RPKM 来衡量样本间的基因表达丰度, 以|log₂foldchange|≥1,P<0.05,FDR≤0.001筛选出样本间的差异表达基因, 并通过 Gene Onto 1ogy (GO ) 数据库、 KEGG pathway 数据库对筛选出的差异表达基因的功能和参与的调控路径进行分析。【结果】 与正常水分处理相比,耐旱自交“PHBA6”和干旱敏感自交系“吉63”在干旱胁迫下分别有1 394个和1 300个显著差异表达基因,其中共有差异表达基因831个,包括上下调表达趋势是一致的822个基因和9个具有相反的表达模式基因。除这些基因外,各自分别还有563个和469个基因型特异的干旱响应基因,这些特异的干旱响应基因的G0 富集分析的条目并不完全相同,除共同富集在刺激响应,细胞壁改变外,耐旱自交“PHBA6”还富集在激素合成调控,机氮化合物代谢、蛋白结合上,特异的干旱响应基因的KEGG 显著性富集分析在2个自交系中也不完全相同,耐旱自交“PHBA6”还有部分差异基因富集在生物素代谢通路上,另外,筛选出耐旱自交“PHBA6”中在干旱胁迫下差异表达的3个脱水素基因和3个特有差异表达的bZIP、MYB和ERF转录因子。【结论】 胁迫相关基因的特异性响应可能是材料间耐旱性存在差异的主要原因,耐旱自交“PHBA6”中的3个脱水素基因和3个特有差异表达的bZIP、MYB和ERF转录因子基因在玉米耐旱育种中可能有重要的利用价值。     

二花脸猪Smad4基因的克隆与卵巢组织mRNA的表达水平

[目的]了解二花脸猪Smad4(common-mediator Sma4)基因的序列特征和组织表达特征,分析二花脸猪与商品猪卵巢组织中Smad4基因mRNA表达水平的差异.[方法]采用克隆测序技术获得二花脸猪Smad4基因cDNA序列,利用生物信息学方法分析二花脸猪Smad4基因的序列特征和蛋白的理化性质、高级结构,RT-PCR检测其组织表达特征,并采用real-time PCR技术检测二花脸猪与商品猪卵巢组织中Smad4基因mRNA的表达水平.[结果]二花脸猪Smad4基因编码区序列全长1 659 bp,编码一个含有5 52个氨基酸残基的蛋白质,氨基酸序列与其它哺乳动物的同源性均在98％以上;二花脸猪Smad4也包括3个典型的结构域(MH1、SAD和MH2).二花脸猪Smad4基因在所检测的组织中均有表达,且卵巢组织中mRNA的表达水平极显著高于商品猪(P＜0.01).[结论]二花脸猪Smad4基因可能拥有其它哺乳动物Smad4基因相同的功能及其可能与猪高繁殖力间有一定相关.     

基于TMT蛋白组学及生物信息学分析牦牛抗冻差异蛋白

【目的】从蛋白水平阐明牦牛抗寒性能机理,并进一步从营养学角度提高其代谢性能,为牦牛有效抵御外界恶劣气候条件提供科学依据。【方法】应用TMT蛋白组学技术对寒冷季节（1月）和温暖季节（8月）的牦牛抗冻蛋白进行挖掘,并对鉴定到的牦牛抗冻蛋白进行亚细胞定位、结构域、GO功能富集、KEGG信号通路注释、蛋白相互作用等生物信息学分析。【结果】从牦牛耳组织中共鉴定获得21856个肽段（Peptide）,其中特有肽段（Unique peptide）序列为18452个,定量获得4519个蛋白,最终筛选出144个差异蛋白,其中上调蛋白89个、下调蛋白55个。144个牦牛抗冻差异蛋白亚细胞定位到7个条目上,分别是细胞核蛋白56个、细胞质蛋白51个、质膜蛋白24个、细胞外蛋白23个、线粒体蛋白18个、细胞骨架蛋白1个和溶酶体蛋白1个;共鉴定到194个结构域。GO功能富集分析结果显示,生物过程主要富集到细胞过程蛋白79个、代谢过程蛋白70个和生物调控蛋白42个等,分子功能主要富集到结合功能蛋白75个和催化活性蛋白64个等,细胞组分主要富集到细胞部分蛋白89个和细胞蛋白89个等。144个牦牛抗冻差异蛋白在KEGG数据库中注释到205条KEGG信号通路,主要涉及核糖体、氮代谢、胞质DNA感受、动物体内生热作用、氧化磷酸化、白细胞介素-17及钙离子信号等通路。牦牛抗冻差异蛋白相互作用网络分析发现L8IHE5的关联度最高,且冷诱导RNA结合蛋白（CIRP）和HSP70结合蛋白在蛋白相互作用网络中具有更多的相互作用关系。【结论】基于TMT蛋白组学对牦牛抗冻差异蛋白进行挖掘,结果鉴定获得144个抗冻差异蛋白（上调蛋白89个,下调蛋白55个）,其中CIRP和HSP70在冷应激条件下呈上调趋势,能促使牦牛肌体适应低温环境,可作为牦牛抗冻性育种的候选分子标记。     

外源CaCl2缓解NaCl胁迫下酸枣幼苗叶和根转录组测序分析

【目的】研究CaCl₂缓解酸枣盐胁迫的分子机制。通过转录组测序分析,为研究CaCl₂缓解酸枣盐害分子机制提供参考。【方法】研究以水培酸枣幼苗为材料,150 mmol/L NaCl和150 mmol/L NaCl + 10 mmol/L CaCl₂分别处理6 h,利用高通量测序技术对酸枣幼苗叶片和根系进行了转录组测序与组装,对获得的所有Unigene在GO、KEGG数据库中进行功能注释。【结果】 与对照组相比,在外源CaCl₂处理下酸枣幼苗叶片上调和下调的差异表达基因分别7 365个和1 247个,根系分别有762个和4 861个。【结论】GO数据库比对,酸枣幼苗叶片富集了43个GO条件,根系富集了42个GO条件,叶片和根系均是催化活性被富集到差异基因最多;KEGG数据库比对,差异基因主要涉及植物病原互作、MAPK信号通路-植物、植物激素信号转导、苯丙醇生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化等。     

他克林对猪精子冻后质量、抗氧化能力及糖代谢的影响

旨在研究他克林对猪精液冻后质量、抗氧化能力及糖代谢的影响机制。手握法采集12头18～24月龄健康杜洛克种公猪精液,在其冷冻保存稀释液中加0.10mmol/L他克林并冷冻保存,检测冻后精子活率、质膜完整率、顶体完整率和畸形率、线粒体膜电位、DNA完整性,同时利用试剂盒检测总抗氧能力、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、总胆固醇含量、丙酮酸含量及己糖激酶活性。结果表明,与鲜精相比,冻融后精子活率和质膜完整率、顶体完整率、线粒体膜电位、DNA完整性、抗氧化能力及糖代谢指标均极显著下降,畸形率极显著升高。与空白组相比,他克林显著提高冻后精子顶体完整率、DNA完整率、超氧化物歧化酶、丙酮酸含量;极显著提高精子活率、质膜完整率、线粒体膜电位、总抗氧能力、丙二醛含量、总胆固醇含量及己糖激酶活性,极显著降低畸形率。总之,猪精液冷冻前添加浓度为0.10 mmol/L的他克林可能通过提高抗氧化能力和糖代谢水平改善冻融后猪精子的质量。