转基因技术在抗植物真菌病害方面的研究策略

重点概述酶基因、抑制蛋白基因、致病相关蛋白基因、降解毒素基因和无致病力基因的抗真菌植物病害中的研究及应用。     

绿色荧光蛋白基因在水稻遗传转化中的应用

本研究构建了含有编码绿色荧光蛋白基因的植物表达载体,以愈伤组织作为外植体,采用农杆菌介导法将携带绿色荧光蛋白的植物表达载体转入水稻品种秀水11中.分析了转化1个月的抗性愈伤组织以及2个月的转基因植株根中绿色荧光蛋白基因的表达.在荧光显微镜下观察到了绿色荧光蛋白基因的表达,转基因水稻愈伤组织和根具有很高的绿色荧光信号.结果表明,在水稻遗传转化研究中,绿色荧光蛋白基因既可用于检测基因的瞬间表达,也可用于检测基因在细胞中的稳定表达.     

绿色荧光蛋白在植物上应用研究进展

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一类存在于海洋生物多管水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的一种功能独特的生物发光蛋白。能够自身催化形成生色团并在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光,能在活细胞内稳定表达。随着进一步对绿色荧光蛋白结构及其发光特性的研究,以及对绿色荧光蛋白基因的成功克隆,对多种新型绿色荧光蛋白的成功改造,使对多种目标进行实时监测成为可能。文中综述了绿色荧光蛋白的发展过程、改进及应用的研究进展。     

非洲绿猴肾细胞外源绿色荧光蛋白基因表达的RNA干扰

非洲绿猴肾细胞(Vero)是多种病毒的适应细胞。本研究将外源的绿色荧光蛋白(GFP)基因转染到Veto-E6中,并利用体外转录合成的绿荧光蛋白短双链干扰RNA(siGFP)其表达进行干扰。结果显示：siGFP能有效阻断外源的绿色荧光蛋白基因在Vero-E6细胞中的表达,而不相关的siRNA则对绿荧光蛋白基因的表达没有影响。这为利用RNAi技术在Vero-E6细胞中,抑制外源基因的表达以及通过RNAi技术进行抗病毒的研究奠定了一定的基础。     

绿色荧光蛋白在秋黏虫细胞中的表达

将绿色荧光蛋白基因编码区克隆到转移载体pBacPAK8,与杆状病毒BacPAK6共转染昆虫细胞,通过同源重组和筛选,构建了整合有绿色荧光蛋白基因的重组病毒。在昆虫细胞中表达的绿色荧光蛋白,在荧光显微镜下呈现绿光。这样,就可在细胞内通过监测其表达情况,以了解病毒在不同细胞中的感染情况。     

辣椒水通道蛋白基因CaTIP1-1启动子的克隆及序列分析（英文）

利用巢式PCR技术分离获得CaTIP1-1基因上游1749 bp的片段。利用PlantCARE软件预测发现该序列含有启动子典型的基本元件TATA-box、CAAT-box及非生物胁迫相关的元件和光应答元件。以PBI121载体为基础,构建CaTIP1-1启动子驱动下绿色荧光蛋白GFP报告基因植物表达载体。利用叶盘法转化烟草获得转基因植株,通过荧光显微镜能够检测到T1代烟草悬浮细胞系能够稳定表达荧光。结果表明该启动子具有驱动绿色荧光蛋白表达的活性。该研究为今后CaTIP1-1启动子在植物基因工程育种中的应用奠定基础。     

辣椒水通道蛋白基因CaTIP1-1启动子的克隆及序列分析

利用巢式PCR技术分离获得CaTIP1-1基因上游1749 bp的片段.利用PlantCARE软件预测发现该序列含有启动子典型的基本元件TATA-box、CAAT-box及非生物胁迫相关的元件和光应答元件.以PBI121载体为基础,构建CaTIP1-1启动子驱动下绿色荧光蛋白GFP报告基因植物表达载体.利用叶盘法转化烟草获得转基因植株,通过荧光显微镜能够检测到T1代烟草悬浮细胞系能够稳定表达荧光.结果表明该启动子具有驱动绿色荧光蛋白表达的活性.该研究为今后CaTIP1-1启动子在植物基因工程育种中的应用奠定基础.     

农杆菌介导的燕麦遗传转化体系的建立

以裸燕麦白燕10号为材料,绿色荧光蛋白为报告基因,建立并优化农杆菌介导的燕麦遗传转化体系,并通过荧光显微镜及PCR方法分别检测燕麦愈伤组织及再生苗中的目的基因。研究结果表明,农杆菌菌体浓度OD600=0.5~0.8,侵染10 min时侵染效率最高,侵染7 d后燕麦愈伤组织可检测到绿色荧光蛋白。PCR检测结果表明,接近60%的再生苗在基因组水平可检测到GFP基因。     

猪胎儿成纤维细胞的分离与基因转染

为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。     

rbcS启动子的克隆及活性鉴定

利用PCR技术从豌豆(Pisum satium Linn)基因组DNA中分离了rbcS基因启动子及叶绿体定位信号编码序列。序列分析表明,扩增片段(1256bp)与已报道序列的相应区域同源性达98.41 %。将其与绿色荧光蛋白基因(GFP)串连在一起,构建了植物表达载体,通过基因枪介导法转化烟草叶片及洋葱表皮细胞。结果表明这一表达系统增强了绿色荧光蛋白基因的瞬时表达,从而为外源基因在转基因植物中的高效表达提供了新的工具,可以实现目的基因的组织特异性和光诱导性表达。     

A minirhizotron imaging system to identify roots expressing the green fluorescent protein

The limited flexibility available in the configuration of commercial minirhizotron imaging systems makes it difficult to adapt these systems to new applications. It is also too expensive to introduce modifications, which are often very temporary to these systems at the end of the development process.In order to identify the roots of a single species in mixed plant stands, we developed a new minirhizotron imaging system that makes it possible to observe roots expressing green fluorescent protein (GFP). This system is based on affordable and easily obtainable components such as webcams. Here, we report a protocol to identify suitable webcams for constructing a minirhizotron imaging system and demonstrate the application of this protocol to build a minirhizotron imaging system that can identify the roots of a transformed maize plant expressing GFP.     

植物亚细胞定位载体卡盒pCEG的构建及验证

GFP基因被广泛地应用于植物转基因以及基因功能验证研究,然而构建与GFP融合的植物表达载体,常会因酶切位点难以选择,而使得载体构建过程复杂,周期长.以含GFP的质粒pCAMBIA-1302为基础,消除此质粒本身的多克隆位点(MCS),并在此质粒GFP基因序列前插入原核表达载pET-32b的多克隆位点,构建了植物GFP亚...     

Using of green fluorescent reporter gene (GFP) to monitor the fate of Fusarium moniliforme mycoparasitized by Trichoderma viride

Fusarium moniliforme Sheld.is a rice pathogenic fungus and causes the disease called Bakanae,which has increasingly damaged rice production in the recent years. Trichoderma spp. has been one of the most widely used biological control agent of plant disease. By geneticaly labelling F. moniliforme with the GFP reporter gene, we have studied the antagonistic action of Trichoderma viride against this pathogenic fungus. The binary GFP reporter vector pCHF3-35S∷GFP was constructed, w…     

带有GFP标签的油松苯丙氨酸解氨酶基因表达载体的构建

利用基因重组技术,将油松的苯丙氨酸解氨酶基因（TaPAL）克隆到PBI121植物表达载体中,并且用报告基因GFP替换了GUS,构建了包含绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物重组表达载体PBI121-GFP-TaPAL,GFP标签比GUS基因更加易于检测,方便进行TaPAL功能鉴定方面的研究。利用电击法将重组表达载体成功的转化进农杆菌GV3301中。该研究可以为深入研究苯丙氨酸解氨酶的结构及功能及进一步通过导入次生代谢关键酶来提高植物的抗病育种提供基础。     

RNA mimics of green fluorescent protein

Green fluorescent protein (GFP) and its derivatives have transformed the use and analysis of proteins for diverse applications. Like proteins, RNA has complex roles in cellular function and is increasingly used for various applications, but a comparable approach for fluorescently tagging RNA is lacking. Here, we describe the generation of RNA aptamers that bind fluorophores resembling the fluorophore in GFP. These RNA-fluorophore complexes create a palette that spans the visible spectrum. An RNA-fluorophore complex, termed Spinach, resembles enhanced GFP and emits a green fluorescence comparable in brightness with fluorescent proteins. Spinach is markedly resistant to photobleaching, and Spinach fusion RNAs can be imaged in living cells. These RNA mimics of GFP provide an approach for genetic encoding of fluorescent RNAs.     

植物病毒表达载体pCIYVV／CP／W的构建及GFP表达

[目的]研究了植物病毒表达载体pCIYVV／CP／W的构建及用pClYVV／CP／W表达绿色荧光蛋白（GFP）,为植物反应器生产有用蛋白、开发有效的植物病毒载体提供参考。[方法]用三叶草黄脉病毒侵染性全长cDNA克隆pCIYVV基因组的NIb／CP基因之间的一段多克隆位点和两侧含有病毒蛋白酶NIa切割识别序列的多聚脱氧核糖核苷酸接头,构建pCIYVV／CP／W载体,并将绿色荧光蛋白基因插入pCIYVV／CP／W中构建pCIYVV／CP／W／GFP载体,用反转录PCR对重组病毒克隆转录情况进行检测,并用Western杂交对重组病毒克隆表达的目的基因产物进行测定。[结果]pCIYVV／CP／W／GFP接种的蚕豆幼苗表现出与野生型CIYVV相同的症状,发病率达100％,表明重组病毒克隆pCIYVV／CP／W／GFP．有侵染性,外源基因的插入没有破坏载体pCIYVV／CP／W的开放阅读框;以感染叶总RNA为模板,对pCIYVV／CP／W／GFP表达GFP外源基因的稳定性进行了检测,从F0（重组病毒质粒最初转录出的病毒）一直检测到Fd子代病毒。检测结果表明,外源基因在L子代病毒基因组中稳定存在;以从感染叶中提取的总蛋白为抗原,以GFP抗体为第1抗体,以碱性磷酸酶标记抗体为第2抗体,用Western杂交对重组病毒克隆pCVYVV／CP／W／GFP表达外源蛋白进行了定性检测。从F0一直检测到F4子代病毒。检测结果表明,重组病毒克隆pCIYVV／CP／W／GFP至少到F4子代病毒能稳定表达GFP。     

植物抗病反应及系统获得抗性研究进展

植物在与病原菌长期共同进化的过程中,形成了一整套复杂而有效的防御机制。植物的抗病反应是建立在一定的物质基础上的,木质素、植保素、活性氧、水杨酸等在植物抗病反应中起着重要的作用。系统获得抗性是植物抵抗病原菌侵袭的相当复杂的防御机制之一,其信号转导途径是近年来研究的热点。本文综述了植物抗病反应及其系统获得抗性的研究进展,并对发展具有广谱抗性的作物和利用激活系统获得抗性的化学物质来保护植物进行了讨论。     

植物抗病基因工程研究进展

随着分子生物学的不断发展,人们已逐步了解植物寄主与病源之间的相互作用及植物抗病的分子机理。本文综述了近年来植物抗病的分子生物学研究进展,并对其发展和应用前景作了展望。     

几丁质酶在植物病害生物防治中的应用

主要对几丁质酶的特性、功能及其在植物真菌病害防治中的应用进行了综合论述。在此基础上,对几丁质酶在植物病害生物防治中的应用前景进行了展望。     

水稻OsWrky基因的细胞核定位研究

绿色荧光蛋白（GFP）基因是一种被广泛应用的报告基因。为了了解克五笔型的水稻WRKY（OsWrky）基因的核定位性质，将OsWRKY与GFP基因融合，并构建在Ubiquitin启动子控制的pCambia130载体上（pCU-oSwrkyGFP)。利用基因枪介导的方法将pCU-OsWrkyGFP导入洋葱内表皮后，荧光显微镜观察GFP的发光部位仅在细胞核内，而作为对照的没有融合OsWRKY基因的载体（pCU-GFP)轰击后细胞质和细胞核中都有荧光。充分说明OsWRKY能作为一个转录因子在细胞核内起作用。