使用二重PCR方法快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究

本研究以单核细胞增生性李斯特菌Hly基因和InlA基因作为靶序列设计2对引物,建立了检测单增李斯特菌的二重PCR方法。结果表明,该方法可以同时扩增出单增李斯特菌的Hly基因和InlA基因,而对大肠杆菌、沙门氏菌等食品中的常见致病菌和英诺克李斯特菌均不能扩增出任何条带,表现出良好的特异性。二重PCR方法的最低检测限为104CFU/mL,并能够用于鉴定实验小鼠攻毒后内脏器官的单增李斯特菌分离培养物。该方法表现出良好的特异性、敏感性和通用性,适用于单增李斯特菌的快速鉴别检测。     

针对单增李斯特菌iap基因PCR检测方法的建立及其应用

为了建立快速、简便的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)PCR检测方法,试验根据Gen Bank上已发表的单增李斯特菌iap基因序列,设计1对特异性引物,通过优化各种条件建立针对iap基因的单增李斯特菌的PCR检测方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行评估及初步临床应用。结果表明:建立的PCR检测方法的最佳退火温度为60℃,Mix最佳使用量为12.5μL,模板使用量为30 ng;该方法对单增李斯特菌纯培养物的检测限为1×105cfu/m L,且能够区分单增李斯特菌和英诺克李斯特菌,对沙门氏菌、大肠杆菌及猪链球菌均无交叉反应;对42份疑似感染单增李斯特菌临床样品进行PCR检测,有7份扩增结果呈阳性,与传统分离培养结果一致。说明试验所建立的PCR方法可用于食品中单增李斯特菌的检测。     

单核细胞增生李斯特菌重组酶聚合酶恒温扩增快速检测方法的建立

为建立基于重组酶聚合酶等温扩增(RPA)技术的单核细胞增生李斯特菌快速检测方法,本研究针对单增李斯特菌的基因组序列设计特异性引物,通过对反应体系的优化确定最佳反应温度为42℃和最佳反应时间为15 min。特异性试验结果显示:本研究建立的RPA方法与伊氏李斯特菌、无害李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、肠致病性大肠埃希菌O157、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均无交叉反应;敏感性试验结果显示:该方法对单增李斯特菌基因组DNA和菌液的最低检出限分别为3×10~2拷贝/μL和10~3cfu/mL。利用本研究建立的RPA快速检测方法分别对50份人工污染的牛奶、牛肉和鱼肉样品进行检测,并与荧光定量PCR检测结果进行对比,结果一致。本研究建立的单增李斯特菌RPA检测方法具有反应快速、灵敏度高、特异性强、操作简便的特点,适用于基层实验室和现场快速检测。     

环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法快速检测单增李斯特菌的研究

为建立一种快速、便捷的单增李斯特菌检测方法,本研究针对单增李斯特菌hlyA基因设计了4条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素标记的探针,采用环介导等温扩增(LAMP)与横向流动试纸条检测技术(LFD)联合应用,建立了一种快速、便捷的单增李斯特菌LAMP-LFD检测方法。通过对其反应条件进行优化,结果显示,优化后的扩增温度和时间为63℃反应50 min,完成检测全过程仅需80 min。该方法仅可以特异性地检出单增李斯特菌,而对其它6种常见食源性致病菌的检测均呈阴性。对纯细菌培养物的检测灵敏度为3.6 cfu/m L,是利用外引物建立的PCR方法的100倍。该方法重复性好。对15份牛奶和15份猪肉的细菌分离鉴定和LAMP-LFD检测表明,二者符合率为100%。研究结果表明,本研究建立的LAMP-LFD方法能够快速、特异地检测单增李斯特菌,适合基层实验室、应急检测或现场监测等使用,具有较高的推广价值。     

单增李斯特菌单克隆抗体制备及免疫磁珠分离方法的建立

免疫磁珠技术操作简单、快速高效，目前已广泛应用于细菌的快速分离纯化等领域，本研究旨在建立一种捕获率高、特异性好的单增李斯特菌免疫磁珠分离方法。首先通过杂交瘤技术制备出8株抗单增李斯特菌单克隆抗体，效价均达到1∶1 024 000,且特异性较好。利用效价最高的腹水6-E6制备单增李斯特菌免疫磁珠，并对单增李斯特菌免疫磁珠最适条件进行优化，结果选择MEST(7.0)为偶联缓冲液、磁珠直径为750 nm、免疫磁珠添加量为0.4 mg、捕获时间45 min、单增李斯特菌含量在1×10⁴ CFU/mL时，免疫磁珠捕获率最高可达76.29%。在模拟牛奶样品中免疫磁珠特异性捕获率可达到67.71%。该分离方法可快速且特异地分离单增李斯特菌，操作简便，为快速分离食品中的单增李斯特菌并实现快速检测提供了技术支持。     

5种猪源消化道传播病原体荧光定量PCR检测方法的建立

猪源人兽共患病不仅威胁公共卫生安全,还威胁生猪养殖业的健康发展;其中消化道传播是其主要的传播途径。为及时鉴定出经消化道传播的病原体,本试验建立了猪源大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌和志贺菌的四重荧光定量PCR和戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法,并优化反应体系和条件,实现5种病原体的同时检测;并利用荧光定量PCR与普通PCR对117份猪临床样品(病变组织、粪便和肌肉等)进行对比检测。结果显示,建立的荧光定量PCR能够在1.5 h内完成对大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌、志贺菌和戊型肝炎病毒5种病原体的特异性检测,与其他常见细菌和病毒无交叉反应,检测极限值可达5个拷贝,标准曲线相关系数均不低于0.997,线性范围涵盖1×10¹～1×10⁹,批内和批间变异系数(CV)均低于3.16%。建立的荧光定量PCR与普通PCR方法检测结果的符合率达到95.73%～100%,具有较好的一致性。117份临床样品中大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌、志贺菌和戊型肝炎病毒各自的阳性率分别为31.62%、17.95%、6.84%、5.13%和11.11%。结果表明,本试验所...     

1株环境源单增李斯特菌的分离鉴定及生物特性分析

【目的】探究牦牛屠宰场中存在的单增李斯特菌对牦牛肉造成污染的风险。【方法】通过细菌分离培养、形态观察、生化试验及分子学方法对牦牛屠宰场50份污水样品中的单增李斯特菌进行分离鉴定;通过PCR方法对分离株血清型和毒力基因进行鉴定和检测,并测定分离株在不同生长条件下D_{600 nm}值;通过细胞的黏附和侵袭试验及小鼠半数致死量(LD₅₀)确定分离株的毒力。【结果】从50份污水样品中分离出1株革兰氏阳性短杆状细菌。分离株在李斯特菌显色培养基上为蓝绿色菌落,镜检为革兰氏阳性两端钝圆的短杆状菌,疑似为单增李斯特菌。生化试验结果显示,分离株可水解七叶苷,发酵葡萄糖、麦芽糖和鼠李糖,MR、VP、动力、过氧化氢酶试验为阳性,甘露醇和木糖发酵试验为阴性。系统进化树显示,分离株与单增李斯特菌EDG-e具有高度同源性,序列相似性为99%,血清型鉴定其血清型为1/2a。毒力基因检测结果显示,分离株携带inlB、inlC、inlJ、actA、plcA、prfA、mpl、hly、inlA、SigmaB毒力基因。抗应激能力试验显示,分离株在低温、强酸、强碱、高盐、乙醇胁迫和氧化...     

李斯特氏菌因子血清的制备及食品检测的免疫磁性分离——PCR（MI …

首先进行了李斯特氏菌因子血清的研制,制备出了可对所有李斯特氏菌分型的１５个Ｏ抗原因子和４个Ｈ抗原因子的因子血清。利用复合因子血清的多克隆抗体包被磁性球、对食品中的单核细胞增多性李斯特氏菌进行免疫磁性分离,并与ＰＣＲ方法相结合,建立了检测食品中单核细胞增多性李斯特氏菌的ＭＩＰＡ样品的检测表明,本方法能够有效地克服食品基质、培养基成分和杂菌对ＰＣＲ检验的干扰作用。食品样品在ＥＢ增菌液中增菌１２ｈ后,检     

应用PCR检测单核细胞增生性李斯特氏菌

单核细胞增生性李斯特氏菌（Listeria Monocytogenes，LM0）简称单增李氏菌，是一种重要的人畜共患病和食源性病原菌之一，可引起人和多种动物的脑膜炎、败血症及流产等症状，死亡率达30％～40％，对畜牧业生产和人类健康构成严重威胁。传统的分离鉴定方法检测周期长、操作繁琐，不能满足食品快速检测和疾病暴发时诊断的需要。而PCR方法具有检测速度快、操作简便和特异性强等优点。本试验通过扩增hly基因部分片段，建立单增李氏菌PCR检测方法。     

单增李斯特氏菌ActA的原核表达与纯化

PCR扩增单增李斯特氏菌ActA基因,纯化后克隆到pMD 18T simple vector 中,以BamHI和EcoRI双酶切克隆载体pMD-18T/ActA,再将其亚克隆到表达载体pGEX-3X中,获得重组质粒 pGEX-3X/ActA,转化E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导融合蛋白(GST-ActA)表达,Western blot分析表明该蛋白可与单增李斯特氏菌多克隆抗体发生特异性反应.试验采用Glutathione Sepharose 4B亲合层析纯化融合蛋白.对单增李斯特氏菌ActA的原垓表达与纯化的研究为单增李斯特氏菌诊断试剂的研制及Acth的免疫原性研究奠定了基础.     

肉类及其制品中单增李斯特氏菌的控制方法

单增李斯特氏菌在自然界广泛分布,是一种能感染人类的致死率较高的食源性致病菌。肉制品的保存关键问题之一是解决单增李斯特氏菌的生长,研究开发高效、低毒并对单增李斯特氏菌有明显抑制作用的新型防腐剂显得尤为重要。本研究从天然香料、化学抑制和微生物抗菌三个方面介绍控制单增李斯特氏菌的方法。     

一株单核细胞增生李斯特菌分离株的分子分型鉴定及其生物学特性

从上海某羊养殖场获得了一株单核细胞增生李斯特菌分离株CMG47。为了确定该单核细胞增生李斯特菌分离株的分子分型,了解其生物学特性,本研究通过多重PCR对该菌株进行谱系和血清型分析,利用多位点序列分型(MLST)方法鉴定其分子分型。采用PCR方法对主要毒力基因进行检测,并通过体外观察和荧光定量PCR对菌株溶脂溶血特性进行分析。将菌株通过腹腔注射ICR小鼠和静脉注射斑马鱼,测定其毒力。研究结果表明该分离株属于谱系Ⅰ,1/2b血清型;序列分型为ST619;携带prfA、inlA、inlB、plcA、plcB、mpl、actA、hly等主要毒力因子;体外无明显溶脂活性,溶血活性较弱;小鼠和斑马鱼试验均显示,该分离株属于强毒株,与强毒参考株EGDe的毒力相当(P0.05)。该分离株的谱系/血清型为引起李斯特菌病的主要型别,拥有整套主要毒力因子,为单增李斯特菌强毒株。本研究为李斯特菌病散发病例的流行和传播特征分析提供了分子生物学基础,对建立健全李斯特菌监测体系和风险评估意义重大。     

食源性单增李斯特菌的分离鉴定及药物敏感试验

为了了解常规送检食物中单增李斯特菌的污染现况和分离株的药物敏感性,对2014年新疆生产建设兵团8个师常规送检的727份食品应用国标法进行细菌分离鉴定,采用Kirby-Bauer(K-B)纸片扩散法进行药物敏感试验。结果显示,从727份食品样品中分离出24株细菌,经革兰染色,培养特性和生化特性鉴定为单增李斯特菌。食品单增李斯特菌总检出率为3.3%,其中调理肉制品检出率最高,达17.77%,其次是冷冻鱼糜制品,检出率为4.95%。药敏试验表明, 24株单增李斯特菌对青霉素和环丙沙星耐药;大部分菌株对亚胺培南、强力霉素、万古霉素和庆大霉素敏感。表明送检食品不同程度受到单增李斯特菌的污染,食源性分离菌株出现多重耐药现象,提示食品安全不容忽视。     

冷冻食品中单核细胞增生性李斯特菌的分离鉴定

随机从锦州市的超市中采集速冻食品,通过细菌的增菌、分离纯化、生化鉴定确定是单核细胞增生性李斯特菌。通过细菌的血清学鉴定确定其血清分型。通过本研究了解单增李斯特菌在速冻食品中的污染情况,为防治疾病提供依据。     

李斯特氏菌因子血清的制备及食品检测的免疫磁性分离-PCR(MIPA)方法的建立

首先进行了李斯特氏菌因子血清的研制，制备出了可对所有李斯特氏菌分型的 １５ 个 Ｏ 抗原因子和４ 个 Ｈ 抗原因子的因子血清。利用复合因子血清的多克隆抗体包被磁性球，对食品中的单核细胞增多性李斯特氏菌进行免疫磁性分离，并与 Ｐ Ｃ Ｒ 方法相结合，建立了检测食品中单核细胞增多性李斯特氏菌的 Ｍ Ｉ Ｐ Ａ方法（免疫磁性分离—聚合酶链反应方法，ｍ ａｇｎ ｅｔｉｃ ｉｍ ｍ ｕｎｏｐｏｌｙｍ ｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）。对菌液、模拟样品的检测表明，本方法能够有效地克服食品基质、培养基成分和杂菌对 Ｐ Ｃ Ｒ 检验的干扰作用。食品样品在 Ｅ Ｂ增菌液中增菌 １２ ｈ 后，检测的敏感度达 ５ Ｃ Ｆ Ｕ／ｍ Ｌ，可以在 ２０ ｈ 内完成检测。本方法对实际食品样品的检测结果，与国家标准检验方法检测的结果一致。     

冷冻食品中单核细胞增多性李斯特菌的分离鉴定

随机从锦州市的超市中采集速冻食品,通过细菌的增菌、分离纯化、生化鉴定确定是单核细胞增多性李斯特菌。通过细菌的血清学鉴定确定7株单增李斯特菌的血清型分别是3株为1/2b,2株为1/2 a,2株为1/2 c。通过本研究了解单增李斯特菌在速冻食品中的污染情况,为防治疾病提供依据。     

一株单核细胞增生李斯特菌分离株的分子分型鉴定及其生物学特性

从上海某羊养殖场获得了一株单核细胞增生李斯特菌分离株CMG47。为了确定该单核细胞增生李斯特菌分离株的分子分型,了解其生物学特性,本研究通过多重PCR对该菌株进行谱系和血清型分析,利用多位点序列分型（MLST）方法鉴定其分子分型。采用PCR方法对主要毒力基因进行检测,并通过体外观察和荧光定量PCR对菌株溶脂溶血特性进行分析。将菌株通过腹腔注射ICR小鼠和静脉注射斑马鱼,测定其毒力。研究结果表明该分离株属于谱系Ⅰ,1/2b血清型;序列分型为ST619;携带prfA、inlA、inlB、plcA、plcB、mpl、actA、hly等主要毒力因子;体外无明显溶脂活性,溶血活性较弱;小鼠和斑马鱼试验均显示,该分离株属于强毒株,与强毒参考株EGDe的毒力相当（P>0.05）。该分离株的谱系/血清型为引起李斯特菌病的主要型别,拥有整套主要毒力因子,为单增李斯特菌强毒株。本研究为李斯特菌病散发病例的流行和传播特征分析提供了分子生物学基础,对建立健全李斯特菌监测体系和风险评估意义重大。     

豫西地区市售鸭翅中单增李斯特菌毒力基因的检测

为分析来自豫西地区市售鸭翅中单增李斯特菌毒力基因的分布变化,本研究以分离自豫西地区市售鸭翅的11株单增李斯特菌分离株为研究对象,利用PCR方法进行8种毒力基因的检测(inlA、inlB、virR、mprF、dltA、dltB、dltC、dltD基因)。结果显示有3株出现了基因缺失,dltA基因检出率为90.9%(10/11),dltC、mprF基因检出率均为81.8%(9/11),其他基因全部呈阳性。这些毒力基因在单增李斯特菌分离株中分布广泛,对豫西地区市售鸭翅具有潜在的威胁,应引起食品监管部门的高度关注。     

三重荧光PCR检测食源性致病菌方法的建立与初步应用

根据大肠杆菌O157的rfbE基因、志贺肠杆菌ipaH基因、单增李斯特杆菌hlyA基因的保守序列,设计引物和探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度、特异性和重复性,建立了可同时检测上述3种食源性致病菌的多重实时荧光PCR方法。试验结果显示,该方法对大肠杆菌O157、志贺肠杆菌、单增李斯特杆菌进行3联扩增的相对灵敏度检测限分别为5×10~2、5×10~2和5×10~3CFU/mL;对10株标准/参考菌株的检测结果,只有目的菌株呈阳性反应;用该方法检测26份冻肉样品,与传统的细菌分离鉴定法结果一致,说明研究建立的方法是鉴定3种食源性致病菌的有效方法。     

新疆不同来源单核细胞增生李斯特氏菌血清型的多重PCR鉴定

为鉴定分离自新疆北疆绵羊单核细胞增生李斯特氏菌,本研究采用多重PCR方法,鉴定来自病发地区部分羊场的发病绵羊、健康绵羊、羊舍环境和乌鸦粪分离的30株李斯特氏菌分离株的8株单核细胞增生李斯特氏菌分离株血清型。结果为4株发病绵羊株有3株鉴定为单核细胞增生李斯特氏菌,血清型为1/2a或4b,1株为非单核细胞增生李斯特氏菌;5株健康绵羊株血清型为1/2a;其余来自羊舍水源的3株、乌鸦粪的2株及健康绵羊16株为非单核细胞增生李斯特氏菌,表明来自发病绵羊、健康绵羊及参考菌株LM血清型之间具有相关性。