小麦硝酸盐转运蛋白TaNRT1.1 1A转录活性检测及互作蛋白筛选

为了进一步解析小麦硝酸盐转运蛋白TaNRT1.1-1A的调控机制，本研究对其进行了自激活性检测。利用已构建好的小麦酵母cDNA文库，以TaNRT1.1-1A为诱饵，通过酵母双杂交技术筛选其互作蛋白，回转试验进一步验证其互作关系。结果表明，TaNRT1.1-1A无自激活活性，酵母双杂技术筛选小麦cDNA文库，共获得2个候选互作蛋白，候选蛋白Sdr I-like主要参与植物病害有关的应答响应。Sdr I-like的回转验证结果表明，该蛋白可能与TaNRT1.1-1A存在互作关系。该结果可为进一步研究TaNRT1.1-1A调控小麦硝酸盐吸收有关的分子机制奠定基础。     

茄子 Enhanced disease susceptibility 1 互作蛋白的初步筛选与分析

前期研究表明,茄子 Enhanced disease susceptibility 1（SmEDS1）正调控茄子青枯病抗性,但是其抗病机理有待进一步研究。为筛选 SmEDS1 的互作蛋白,本研究构建 pGBK7-SmEDS1 诱饵载体,并利用酵母双杂交技术对相应的均一化 cDNA 酵母文库进行筛选。从 2 次独立的实验中筛选到 9 个克隆,其非冗余地编码 6 种蛋白,即 TCP 转录因子、DNAJ 分子伴侣、SnRK1 蛋白 α 亚基、氰酸酯酶、CIP4 蛋白和 1 个未知蛋白。基于这些蛋白的功能,推测 SmEDS1 可能通过与本研究筛选到 TCP 转录因子互作调控水杨酸的合成,进而调控茄子的青枯病抗性。     

大豆GmWRKY52生物信息学分析及与GmNF-YA13互作研究

WRKY转录因子在植物生长发育及逆境调控过程发挥着重要作用。前期通过酵母双杂交筛选干旱处理后的大豆cDNA文库时发现GmWRKY52(NP＿001237726.2)可能与GmNF-YA13蛋白存在互作，为明确二者是否存在互作，本研究克隆GmWRKY52基因并进行生物信息学分析，利用酵母双杂交系统鉴定GmWRKY52和GmNF-YA13之间的互作关系。结果显示：GmWRKY52基因全长1 163 bp,编码1个由265个氨基酸组成的蛋白质，多序列比对和系统发育树分析结果说明GmWRKY52基因与野生大豆GsWRKY69(XP＿028186817.1)亲缘关系较近。酵母双杂交结果表明GmWRKY52和GmNF-YA13蛋白不存在相互作用。研究结果说明GmWRKY52与GmNF-YA13蛋白在酵母细胞内并不发生互作。     

木薯MYB转录因子MeMYB2特性及功能分析

MYB转录因子是植物最大的转录因子家族之一,其部分成员在植物非生物胁迫响应过程中发挥着重要的调控作用。通过转录组数据分析,筛选到了多个木薯干旱胁迫相关的MYB类基因,本研究针对其中的1个MYB转录因子MeMYB2展开研究。MeMYB2蛋白N末端与AtMYB60蛋白的N末端氨基酸序列具有95%以上的相似度,但其C末端氨基酸序列与AtMYB60只有30%左右的相似度。编码该蛋白的基因在木薯成熟叶片中优势表达,并且其表达受干旱胁迫负调控。MeMYB2蛋白主要定位于细胞核中,且在酵母中具有明显的转录自激活活性,其转录激活结构域在蛋白C末端247~267位点之间的20个氨基酸残基内。利用酵母双杂交系统从木薯cDNA文库中筛选到了8个与MeMYB2互作的蛋白,其中的2个蛋白与气孔运动和光合作用有关。MeMYB2-RNAi转基因木薯成熟叶片的失水率显著低于野生型木薯成熟叶片,说明MeMYB2转录因子负调控木薯叶片失水率,推测其可能具有调控气孔运动的功能。     

酵母双杂交系统筛选与水稻条纹病毒Pc2互作的寄主蛋白基因片段

水稻条纹病毒编码的Pc2蛋白在病毒侵染及宿主症状发生中起作用。研究其与寄主间的分子互作有助于揭示病毒侵染与致病的分子机制。分别将编码Pc2 N端（Pc2-N）与Pc2 C端（Pc2-C）的基因片段克隆到酵母双杂交诱饵载体pGBKT7上，并构建水稻叶片cDNA文库，然后分别用Pc2-N和Pc2-C为诱饵筛选文库寻找与其互作的寄主因子。结果表明，诱饵载体中插入的Pc2-N和Pc2-C编码框和氨基酸序列均正确。Pc2-N对酵母菌株AH109无毒性和自主激活能力，但Pc2-C对酵母具有细胞毒性。文库滴度为4×107 CFU/mL，且大多数插入片段在500~2 000 bp之间。利用Pc2-N为诱饵筛选水稻cDNA文库，获得有8个候选阳性克隆。经序列测定和BLAST分析结果表明，这些克隆共编码5种蛋白，主要为胁迫相关蛋白与光系统相关蛋白。     

玉米光周期敏感性基因ZmDPS10-2启动子结合蛋白筛选研究

以玉米光周期敏感基因ZmDPS10-2的核心启动子(1148 bp)为诱饵,采用酵母单杂交技术,从热带玉米自交系酵母单杂交文库中,筛选到33个与ZmDPS10-2的启动子相互作用的蛋白,并根据基因功能注释,从中选出了4个与光周期响应和逆境响应相关的蛋白PAO4、RPL23A、bZIP60和BAG。通过构建pGADT7载体做进一步回转验证,初步证实他们与候选基因启动子之间存在互作关系。结合启动子功能元件的预测,推测ZmDPS10-2候选基因可能在植物开花、ER胁迫、热胁迫等逆境调控途径中有一定的功能作用。     

用酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒CP互作的寄主因子

为筛选与小麦黄花叶病毒外壳蛋白(wheat yellow mosaic virus coat protein,WYMV-CP)互作的小麦蛋白,构建了小麦茎叶酵母双杂交cDNA文库,并从中筛选获得了与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段。从小麦茎叶中提取小麦总RNA,分离mRNA后,利用GATE-WAY技术将反转录得到的小麦cDNA片段定向转移到目的载体,同源重组反应后成功构建小麦cDNA文库。经检测,小麦cDNA文库的滴度为5.86×106 CFU·mL-1,库容量为2.34×107 CFU,重组率为95.8%。根据NCBI上WYMV-CP开放阅读框信息,构建了诱饵载体pGBK-CP,通过酵母双杂交筛选获得了若干阳性克隆,共转化试验初步验证了WYMV-CP与PEPCK、PAL等蛋白的互作关系。本研究利用酵母双杂交技术成功获得与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段,为明确WYMV的致病机制提供了科学的依据。     

大豆酵母杂交cDNA文库的构建及GmSPX3互作蛋白的筛选

为研究Gm SPX3在大豆低磷胁迫响应中的作用机制,寻找与Gm SPX3发生相互作用的蛋白质,利用Gateway技术构建了低磷大豆根系酵母杂交c DNA文库,并使用p GBKT7-Gm SPX3融合蛋白为诱饵,采用酵母双杂交方法筛选酵母杂交c DNA文库,经过显色反应验证后获得21个阳性克隆,通过生物信息学分析,选择2个转录因子编码基因Gm UNE12和Gm Pos F21作为候选基因进行克隆,并分别构建AD载体p GADT7-Gm UNE12和p GADT7-Gm Pos F21,与诱饵p GBKT7-Gm SPX3进行一对一互作验证,结果证明Gm UNE12和Gm Pos F21蛋白均与Gm SPX3诱饵蛋白发生了相互作用。     

酵母双杂交系统筛选与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻蛋白

RBSDV编码的非结构蛋白P6为该病毒的沉默抑制子。为了研究P6与寄主水稻间的互作关系,首先利用RT-PCR扩增,获得水稻黑条矮缩病毒P6基因,并将其构建到酵母表达载体pGBKT7上,自激活验证表明,P6蛋白无自激活活性。利用酵母双杂交系统顺序转化法从水稻cDNA文库中筛选,获得4个与RBSDVP6互作的寄主因子,分别为水稻内囊体抗坏血酸过氧化物酶、醛糖1差向异构酶、immutans蛋白基因同源蛋白和一个功能未知蛋白。分析了3个已知功能的寄主因子在病毒侵染过程中的可能功能。     

巴西橡胶树乳管细胞HblMYC3互作蛋白筛选与功能分析

MYC是b HLH转录因子家族的亚家族成员,在植物茉莉酸信号转导过程中发挥着重要的调节作用。Hbl MYC3是从巴西橡胶树的乳管细胞中分离鉴定到的MYC类转录因子,其基因表达受割胶和茉莉酸上调。采用酵母双杂交方法初步筛选Hbl MYC3蛋白的互作蛋白,旨在进一步了解Hbl MYC3的功能。结果表明:Hbl MYC1、Hbl MYC2、DNAJ蛋白、谷氧还蛋白2、含A20和AN1锌指结构域的胁迫相关蛋白5、28 ku热和酸稳定的磷蛋白以及25 ku泛素连接酶E2等7种蛋白不同程度地与Hbl MYC3蛋白互作。基于这些互作蛋白的功能,推测Hbl MYC1或Hbl MYC2通过与Hbl MYC3形成二聚体对小橡胶粒子膜蛋白基因表达进行调控,其他蛋白参与胁迫条件下维持二聚体的稳定性和胁迫反应后降解该二聚体。     

花生中两个CBF-like基因全长的克隆与序列分析

DREB／CBF类转录因子的功能及作用机理在拟南芥、水稻等模式植物中已经得到了较为充分的研究,但是在花生中还没有关于这类基因的报道,其功能也没有得到证实。本研究通过Bioedit软件在花生eDNA文库中找到了15个可能编码CBF类蛋白的基因片段,其中有2个基因没有包含完整的开放阅读框。我们通过5-RACERT-PCR对...     

剑麻酵母双杂交cDNA表达文库的构建及与AhKNOX2相互作用蛋白的筛选

植物KNOX（Knotted1-like homeobox）可通过蛋白质相互作用参与调控落果、纤维细胞发育、次生细胞壁发育、开花等事件。为筛选剑麻叶中与AhKNOX2相互作用的蛋白,采用SMART同源重组技术构建剑麻叶片酵母双杂交表达文库,利用AhKNOX2为诱饵筛选与之相互作用的蛋白。结果表明：文库总容量为3.9×10⁶ CFU,转化效率为9.15×10⁵ CFU/μg pGADT7-Rec,插入片段大小主要分布于0.5~3.0 kb之间,重组率为92%,保存的文库细胞密度为1.35×10⁸/mL,文库滴度为2.22×10⁷CFU/mL。构建的pGBKT7-AhKNOX2诱饵载体存在自激活性,5 mmol/L的3-氨基- 1,2,4-三唑（3-Amino-1,2,4-triazole,3-AT）能抑制诱饵载体的自激活,通过筛选获得了16个与AhKNOX2相互作用的蛋白。本研究成功构建剑麻叶片酵母表达文库,并筛选获得与AhKNOX2相互作用的蛋白,该结果为进一步研究AhKNOX2在剑麻中的功能奠定前期基础,为培育高纤维产量的剑麻新品种提供基因资源和理论基础。     

农杆菌介导法向小麦茎尖导入DREB1A基因的研究初报

为了研究以小麦茎尖为受体进行农杆菌转化的可行性,选用小麦品种H6756,以茎尖为受体进行了农杆菌转化.构建了含有拟南芥逆境诱导转录因子DREB1A及除草剂bar基因的表达载体pC3300IS-DREB1A,酶切鉴定此载体,结果证明其连接完全正确,具有转录和表达的功能.农杆菌介导法向小麦茎尖导入DREB1A基因,共获得247株转化苗.转化苗经除草剂筛选,获得66株抗性苗,对抗性苗进一步进行PCR检测,有30株抗性苗扩增出特异性片段,转化率达到12.1%,初步说明本试验中以小麦茎尖为受体的转化系统用于基因转化是可行、高效的.     

小麦抗逆相关转录因子DREB密码子偏好性特征分析

DREB(dehydration responsive element binding)转录因子在植物抵抗干旱、高盐、低温等非生物逆境中发挥着重要作用。为探究普通小麦抗逆相关转录因子DREB密码子的偏好性特征,本研究运用CodonW、CHIPS和CUSP软件程序分析了小麦DREB基因的密码子使用特性,并与13种植物的DREB密码子偏性进行比较。结果表明,小麦DREB基因主要偏好以GC结尾的密码子;根据RSCU值,确定小麦DREB基因的高频密码子有14个;不同作物间DREB基因的密码子选用偏好性存在一定差异;基于DREB编码序列的聚类分析比基于密码子使用偏性聚类分析更能准确地反映物种间的亲缘关系;属于真核生物的酵母菌比属于原核生物的大肠杆菌更适宜作为DREB基因表达的异源受体。小麦DREB与模式植物基因组之间密码子使用偏性差异较小,拟南芥可能比烟草和番茄更适合作为该基因转基因研究的理想受体。小麦DREB密码子偏性分析为该基因的异源表达及分子遗传研究提供了一定的理论依据。     

小麦转录因子 TaDREB6基因启动子的克隆及活性分析

启动子的分析有助于解析植物抵御不良环境的机制。植物DREB转录因子参与对干旱、低温和高盐等胁迫的响应,在抗逆中起着重要作用。本研究利用反向PCR方法从小麦中克隆获得DREB转录因子TaDREB6基因启动子,长度为1 705 bp。PLACE和PlantCARE分析发现,TaDREB6基因启动子包含多种胁迫相关元件。构建由TaDREB6基因启动子驱动的GUS植物表达载体,转化小麦成熟胚愈伤组织,组织化学染色结果表明,TaDREB6基因启动子是诱导型启动子,受干旱、低温、盐、脱落酸和水杨酸等胁迫诱导。Real-time PCR显示,TaDREB6基因受多种胁迫诱导表达,与TaDREB6启动子活性分析结果一致,这些结果为进一步分析DREB转录因子的功能提供了依据。     

EaDREB2B互作蛋白的筛选及分析

甘蔗(Saccharum officinarum)是我国重要的糖料作物之一,90％以上的食用糖是由甘蔗产生的,我国有85％以上的甘蔗种植区是分布在旱地,干旱是限制甘蔗生产重要的因素之一.因此,改良和培育抗旱甘蔗新品种对甘蔗产业的发展具有重要意义.AP2/ERF转录因子是植物中特有的基因家族之一,该基因家族成员通过调控逆...     

DREB转录因子在植物抗逆胁迫中的作用机理及应用研究进展

干旱、高盐和低温等非生物胁迫严重影响植物的生长发育和作物产量。转录因子在调节植物生长发育以及对外界环境胁迫的响应方面起着重要作用。DREB转录因子含有一个保守的AP2/EREBP结构域,参与外界环境胁迫的应答响应,通过结合DRE(Dehydration responsive element)顺式作用元件,调控下游胁迫相关基因的转录表达,改良植物的抗性。本文在前人研究的基础上,综述了DREB转录因子的结构特征、介导的信号传递途径、对非生物胁迫的响应以及转基因的研究进展,旨在为作物的抗逆育种提供理论依据。     

接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库的构建与分析

利用Trizol法提取接种PRsv 4 d的番木瓜种苗总RNA,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,双链cDNA末端经Pfu-DNA聚合酶补平,与EcoR I接头连接,XhoI酶切消化产生粘端.用Sepharose CL-2B柱分离纯化去除小分子cDNA片段,再与pMyr酵母表达载体连接,转化受体菌XL10-Gold,构建了接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库.所获得的原始文库的克隆总数为1.8×106cfu,重组率为100%,文库滴度为2.6×109cfu/mL.对随机选取的34个克隆进行PCR鉴定,结果表明插入片段长度均大于O.5 kb且集中在1 kb左右.文库质量鉴定结果表明,该文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段.     

DREB转录因子及其在大豆中的应用

主要介绍DREB转录因子定义、发现、结构和表达调控,以及DREB转录因子在基因克隆和转基因中的应用,阐明DREB转录因子在大豆抗旱耐盐基因工程研究与应用中的重要作用。     

转RD29A:DREB1A融合基因小麦的获得及其抗旱性研究

为了提高小麦的抗旱能力，通过转基因将拟南芥 RD29A:DREB1A转入到小麦品种陇春30中，成功获得三个单拷贝本底DREB1A蛋白低表达水平的纯合转基因家系，并在干旱胁迫下测定了其生理指标及产量相关农艺性状。结果表明，与陇春30相比，转基因小麦的脯氨酸和可溶性糖含量以及SOD、CAT和POD活性都显著提高，H₂O₂含量、MDA含量和相对导电率均显著降低，株高、穗长、穗粒数、千粒重、地上生物量显著增加，说明 RD29A:DREB1A外源基因的导入能够显著增强陇春30的抗旱性。