烟草疫霉侵染后剑麻H.11648叶片细胞超微结构和防御酶活性研究

斑马纹病是剑麻的主要病害之一，本研究以剑麻斑马纹病高感品种H.11648为材料，分别在接种烟草疫霉0、24、36、48、72 h取样，用电镜观察H.11648叶片细胞超微结构变化，同时分析过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和超氧化物歧化酶(SOD)等防御酶活性变化情况。结果表明：H.11648在接种24 h，可见大量休止孢，叶绿体结构被破坏，植物组织开始降解，随着时间延长，附着孢出现，吸器形成，植物组织解体更严重，接种72 h，可见大量菌丝。在整个接种过程中，CAT、PAL和PPO活性显著增强，72 h达到最高，分别为501.44、25.73、1 742.67 U/(g.min)。SOD和APX活性显著下降，72 h达到最低，分别为2 888.62 U/g和841.96 μmol/(g.min)。POD活性先下降72 h又上升，但均显著低于接种前POD活性。本研究从细胞学和生理水平为探讨剑麻与烟草疫霉互作关系提供了理论基础。     

剑麻种质资源表型多样性分析与倍性鉴定

利用常规方法结合流式细胞仪对25份剑麻种质资源叶色、叶缘刺有无、叶缘刺类型、叶顶刺类型、叶长、叶宽、叶长/宽比、叶基厚度、顶刺长、顶刺基部宽等10个农艺性状以及倍性进行了分析和鉴定,结果表明:同一种质资源内叶长、叶宽、叶长/宽比、叶基厚度、顶刺基部宽和顶刺长等变异系数分别在0.9%~13.33%、1.69%~9.13%、1.77%~7.61%、3.99%~11.62%、7.82%~14.31%、9.08%~14.84%之间,不同种质资源间变异系数分别为21.60%、13.95%、15.9%、21.48%、36.59%和30.77%。同一种质资源内叶长、叶宽、叶长/宽比、叶基厚度、顶刺基部宽和顶刺长差异不明显,不同种质资源间存在极显著差异(α=0.05)。基于10个表型性状将25份剑麻种质资源聚为3类,第一类主要包括番麻、广西76416、南亚1号、东368、蓝剑麻、普通剑麻、粤西75等7份种质;第二类主要包括桂辐4号、H.11648、东74、东27、东26和东16等6份种质;第三类主要包括东18、东2、肯3等12份种质。多变量的主成分分析显示4个主成分的特征值总和为5.84,累计贡献率达97.29%。流式细胞仪分析表明,25份剑麻种质资源中,H.11648、东2等14份种质为二倍体,东16和广西76416两份种质为三倍体,粤西75、粤西114等5份种质为四倍体,肯3和普通剑麻2份种质为五倍体,东74为六倍体,番麻为五倍体和六倍体的混倍体。以上结果为剑麻种质资源的鉴定评价提供理论依据。     

剑麻酵母双杂交cDNA表达文库的构建及与AhKNOX2相互作用蛋白的筛选

植物KNOX（Knotted1-like homeobox）可通过蛋白质相互作用参与调控落果、纤维细胞发育、次生细胞壁发育、开花等事件。为筛选剑麻叶中与AhKNOX2相互作用的蛋白,采用SMART同源重组技术构建剑麻叶片酵母双杂交表达文库,利用AhKNOX2为诱饵筛选与之相互作用的蛋白。结果表明：文库总容量为3.9×10⁶ CFU,转化效率为9.15×10⁵ CFU/μg pGADT7-Rec,插入片段大小主要分布于0.5~3.0 kb之间,重组率为92%,保存的文库细胞密度为1.35×10⁸/mL,文库滴度为2.22×10⁷CFU/mL。构建的pGBKT7-AhKNOX2诱饵载体存在自激活性,5 mmol/L的3-氨基- 1,2,4-三唑（3-Amino-1,2,4-triazole,3-AT）能抑制诱饵载体的自激活,通过筛选获得了16个与AhKNOX2相互作用的蛋白。本研究成功构建剑麻叶片酵母表达文库,并筛选获得与AhKNOX2相互作用的蛋白,该结果为进一步研究AhKNOX2在剑麻中的功能奠定前期基础,为培育高纤维产量的剑麻新品种提供基因资源和理论基础。     

剑麻不定芽玻璃化过程中的细胞学和生理变化研究

玻璃化问题是植物组织培养过程中的普遍现象,已成为植物组织快速繁殖的瓶颈。本研究以H.11648为材料,分析H.11648不定芽玻璃化过程中气孔形态、DNA含量、叶片含水量、可溶性蛋白含量、丙二醛(MDA)含量以及过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和超氧化物歧化酶(SOD)等防御酶活性变化情况,结果表明:玻璃化后的不定芽叶片保卫细胞膨大,气孔变大。体细胞DNA含量没有变化,但细胞数减少。随着玻璃化程度的增加,叶片含水量显著增加,可溶性蛋白和丙二醛含量明显降低,POD活性显著上升,SOD活性先上升后又略有下降,但均显著高于正常水平,APX活性先明显上升后又恢复到正常水平,CAT活性略有下降但不显著。本研究为揭示剑麻不定芽玻璃化的生理机制提供参考。     

剑麻与烟草疫霉互作过程中的转录组研究

斑马纹病是剑麻的主要病害之一,为了挖掘剑麻斑马纹病抗病相关基因,以斑马纹病抗病品种热麻1号为材料,分别在接种0、24、36、48和72 h进行转录组测序,组装后获得103 326个转录本和70 110个Unigenes,转录本和Unigene的平均长度分别为726 bp和645 bp。其中有33 474个Unigenes被成功注释到NR,NT,KO,Swissport等7个功能数据库中。DEG分析表明,在接种24、36、48、72 h后分别有4 676、3 769、3 308、3 757个Unigenes被诱导差异表达,且PR蛋白,类黄酮生物合成、苯丙素类生物合成、过氧化物酶等基因上调表达明显,而热击蛋白、细胞色素P450和叶绿素a/b结合蛋白等基因明显下调表达。差异基因代谢通路分析表明,参与核糖体、光合作用、苯丙素类生物合成、苯丙氨酸代谢通路、植物激素信号转导途径、类黄酮生物合成途径、脂肪酸生物合成途径等代谢通路明显富集。本研究全面了解剑麻与烟草疫霉互作关系,是为剑麻斑马纹病抗病机制研究提供理论基础。     

APX基因植物表达双元载体的构建及转化剑麻

剑麻是中国热带地区最重要的麻类经济作物。剑麻H.11648是中国唯一的当家品种，此品种虽高产但易感斑马纹病，而现有的化学农药防效差且病原菌易产生抗性。为了培育出剑麻抗病新品种，以Pcambia3300为基础质粒，构建由35S驱动的APX基因的植物表达载体Pcambia3300-35S-APX-nos，再通过农杆菌EHA105将其导入剑麻中，经PCR扩增后电泳检测分析，结果表明外源基因已整合到受体植物基因组中。     

基于转录组的剑麻SSR标记开发与筛选

本研究基于剑麻转录组测序获得的70 110条Unigene序列,采用MISA 1.0软件查找SSR位点,利用Primer 3.0设计SSR引物,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对其中的100对SSR引物有效性进行验证。总计获得了13 175个SSR位点,SSR的分布频率为15.61%。70 110条Unigene序列总计包括60种重复基元,其中单核苷酸重复为主导重复类型（37.96%）,其次是二核苷酸重复和三核苷酸重复,比例分别为32.92%和27.90%,四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重复所占比例总计为1.21%。A/T、AG/CT和AGG/CCT分别为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复的优势基元。100对SSR引物中有68对引物可扩增出目标产物,其中18对引物在6份剑麻种质中表现出多态性,该结果为利用SSR分子标记技术开展剑麻种质资源鉴定、遗传多样性分析等奠定基础。     

芦笋组培快繁体系的建立

以芦笋高产品种"井岗701"的无菌茎尖为试材,采用正交实验设计方法,研究嘧啶醇、KT、2,4-D、脱落酸、6-BA和NAA等不同植物激素浓度组合对愈伤组织、胚状体以及幼苗诱导的影响。结果表明:MS+2,4-D 2.0mg/L+KT 1.0mg/L诱导愈伤组织效果最好,出愈率达到80%左右。MS+0.70mg/L嘧啶醇+0.10mg/L NAA+0.50mg/L KT诱导胚状体效果最好,诱导率高达95%。MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L诱导胚状体成苗率达到60%左右。室外移栽成活率高达90%,初步建立了芦笋由胚状体到幼苗的一步成苗体系。     

剑麻内参基因筛选与稳定表达分析

为了筛选剑麻中稳定表达的内参基因,保证基因表达结果的可靠性,本研究以热麻1号为材料,采用实时荧光定量RT-PCR方法对来自剑麻转录组数据的8个内参基因（EF1α、MADH、ACT2、GAPDH、TUB、ACT54、CYP和EF1β）在烟草疫霉侵染、水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和脱落酸（ABA）处理过程中的表达水平进行检测,并结合GeNorm、BestKeeper和NormFinder软件综合评价8个内参基因的稳定性。结果表明：8个内参基因在不同处理下的表达稳定性存在显著差异,其中在烟草疫霉侵染和茉莉酸甲酯处理过程中,EF1α表达最稳定,EF1β表达最不稳定。在水杨酸处理过程中,EF1α表达最稳定,ACT2表达最不稳定。在脱落酸处理过程中,GAPDH表达最稳定,ACT54表达最不稳定。该结果为剑麻基因的表达分析提供了可供选择的内参基因。     

剑麻PGIP基因克隆和表达研究

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase inhibitor proteins, PGIPs）是一类与植物自身免疫相关的多功能蛋白, 在植物防卫反应中扮演着重要角色。为了探讨剑麻PGIP基因的功能,本研究利用PCR的方法从剑麻H.11648中克隆2个剑麻PGIP基因——AhPGIP1和AhPGIP2。利用荧光定量PCR（qRT-PCR）分析AhPGIP1和AhPGIP2基因在烟草疫霉侵染、伤害、低温、盐胁迫、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）处理后的表达模式。结果表明：AhPGIP1基因 cDNA全长为1008 bp,编码335个氨基酸,蛋白分子量约为36.7 kDa,等电点为8.65。AhPGIP2基因全长为981 bp,编码326个氨基酸,蛋白分子量约为35.8 kDa,等电点为8.98。AhPGIP1基因在烟草疫霉侵染过程中表达水平先下降后明显上升,侵染48 h达到最大值,在盐、伤、SA和MeJA处理后表达水平明显上升,分别在3、12、3、12 h达到最大值,低温处理6 h表达水平不变,3、12、24 h表达水平明显下降。AhPGIP2基因在烟草疫霉侵染24 、36、48 h表达水平明显下降,侵染72 h明显上升并达到最大值,在盐胁迫、低温、SA和MeJA处理后表达水平明显上升,分别在3、24、3、12 h达到最大值,在伤处理12 h后显著上升并达到最高水平,在3、6、24 h明显下降。本研究为深入探讨剑麻PGIP基因在不同逆境胁迫反应中的功能奠定了基础。