水牛巴贝斯虫病病原—牛巴贝斯虫体外培养的研究

本研究采用微气静相培养技术,对一株采自人工感染的去脾脏水牛犊的牛巴贝斯虫(Babesia bovis)进行了80天的连续体外培养·继代26次,累积增殖6.51×10~((?))倍;累积稀释2.19×10~(35)倍。培养24小时红细胞的染虫率为2.63±0.50％;48小时为7.18±1.39％;72小时为20.78±4 52％。最高红细胞染虫率达33.50％。体外培养的牛巴贝斯虫与采自病牛血液内的牛巴贝斯虫形态一致,说明已建立了水牛巴贝斯虫病病原——牛巴贝斯虫的体外培养。 对影响牛巴贝斯虫体外培养的几种因素进行的实验结果表明:培养液pH值显著地影响虫体的繁殖,最适的体外连续培养的pH为7.2;合适的血清浓度为40％;血清灭活后,支持牛巴贝斯虫生长繁殖的能力明显降低;脱纤血分离的血清和自然凝固血析出的血清用于培养的效果相同;RPMI-1640和TCM-199培养液支持牛巴贝斯虫生长繁殖的能力没有差异。     

寄生于中国水牛Bubalus Vbubalis的巴贝斯虫一新种(梨形虫目:巴贝斯科)

经作者等深入研究，发现湖北省水牛巴贝斯虫病病原不是牛巴贝斯虫Ｂａｂｅｓｉａｂｏｖｉｓ与双芽巴贝斯虫Ｂ．ｂｉｇｅｍｉｎａ，而是一新种——东方巴贝斯虫Ｂａｂｅｓｉａｏｒｉｅｎｔａｌｉｓｓｐ．ｎｏｖ．。病牛红细胞中的虫体呈梨形（单梨形多于双梨形）、椭圆形、指环形、边虫形及杆状。以梨形虫体居多，病的初期其长度均小于红细胞半径，其平均大小为２．２×１．３μｍ，双梨形虫体尖端相连多排列成钝角或一字形，位于红细胞偏中央处。病的后期（出现虫血症后５～６ｄ）及体外培养７２ｈ，有少部份（１～２％）虫体直径大于红细胞半径。新种的传播者为镰形扇头蜱Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｏｉｄｅｓｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｏｉｄｅｓ经卵传递（由第二代成蜱传给健康牛）。在成蜱的血淋巴中的虫样体（裂殖子）呈圆锥状、一端钝圆、尾部直而尖，不形成钩。新种对黄牛不能感染致病，只能使水牛致病。以１９９培养基加黄牛血清进行体外培养（微气静相培养技术）不能生长繁殖     

巴贝斯虫体外培养技术及其应用的研究进展

体外培养巴贝斯虫的工作起始于1978年，由Frp等采用悬浮培养（Suspensionculture，又称旋转培养SpinnerflaskmethodSFM）成功地进行了牛巴贝斯虫的体外培养，但培养中红细胞染虫率不高。1980年，Levy等仿照Trager（1976）培养恶性疟原虫的技术建立了微气静相培养技术（MicroaerophilousstationaryphasecultureMASP），实现了牛巴贝斯虫的体外连续培养并得到了理想的结果。之后，该方法被迅速应用于双芽巴贝斯虫、分歧巴贝斯虫、大巴贝斯虫、犬巴贝斯虫、隐藏巴贝斯虫、马巴贝斯虫等多种巴贝斯虫的体外培养均获成功。目前，该方法已被…     

水牛牛巴贝斯虫低温保存和复苏后的致病力研究

将含水牛牛巴贝斯虫的压积红细胞与等量的１６％二甲基亚砚阿氏液混合后分装于冷冻管内，于液氮中保存。保存２６ｄ，７８ｄ，１４２ｄ和１４９ｄ后，在３８℃温水中复苏，经皮下，静脉和静脉皮下同时感染摘腺小牛获得成功。水牛感染后，外周血液出现虫体时间短的为５ｄ，其余的为８ｄ和９ｋ。血液涂片中发现典型的牛巴贝斯虫，最高染虫率为１５％。由低温保存的含虫血与新鲜虫血和蜱感染一样使水牛发病，出现高温稽留，贫血，黄疸和     

巴贝斯虫病水牛血清钙镁浓度变化与染虫率的关系

自水牛巴贝斯虫病非疫区购买的无任何血液原虫寄生的健康水牛犊２头，人工摘除脾脏后，用从疫区采集的饥饿镰形扇头蜱叮咬感染，观察巴贝斯虫的消长与血清钙、镁浓度的变化，结果发现二者关系密切，其中钙离子浓度与红细胞染虫率呈负相关，镁离子浓度与红细胞染虫率呈正相关，这一发现为进一步研究水牛巴贝斯虫病及在体内外研究巴贝斯虫的生长繁殖均具有重要意义。     

双芽巴贝斯虫体外培养技术初探

应用双芽巴贝斯虫染虫血和液氮保藏株,进行体外培养技术初步研究,获得了生长、增殖和保种效果。双芽巴贝斯虫在牛红细胞内带虫率达５％,低染虫率的连续培养已超过２５ｄ。奠定了双芽巴贝斯虫培养技术应用基础。     

人血清用于体外培养牛巴贝斯虫

在牛巴贝斯虫（Ｂａｂｅｓｉａｂｏｖｉｓ）的培养中，使用不同含量人血清（Ａ型ＲＨ阳性）和牛血清混合物，如：２０％＋２０％（培养液Ⅰ）、３０％＋１０％（Ⅱ）、４０％＋０％（Ⅲ）、０＋４０％（Ⅳ）以及１９９培养液。牛巴贝斯虫稳定株接种给小犊牛，在染虫率６％时使用。培养液每隔２４小时更换一次。每间隔２４小时培养液的颜色白鲜红变为深咖啡色，红细胞染虫率的增加在２４－２８小时内最大。同时也观察到红细胞染虫率在１：２稀释明显高于１：１稀释。在培养液Ⅰ中，５０％牛血清被人血清替代，红细胞染虫率增加最高，然而，该寄生虫不能进一步培养或保存。在微气静相培养中，５０％被替代是最佳选择。该结果也表明牛巴贝斯虫在。牛血清混合物微气静相培养系统中至少能增殖４８小时，这也与巴贝斯虫属人畜共患性相一致。     

牛巴贝斯虫PCR检测及体外培养试验

本试验通过PCR方法检测出牛巴贝斯虫单一感染的牛全血样本,并探讨了牛巴贝斯虫病患牛全血体外培养方法及培养条件。试验结果表明,PCR检测结果显示检测方法效果较好,单一感染样本的新鲜血液中虫体在含40%牛血清的完全培养液和37 ℃、5% CO₂的条件下能建立起牛巴贝斯虫的体外培养,虫体可以连续培养14 d,传代13次,最高染虫率可以达到12.5%,平均染虫率为4%。     

新疆和静县和吐鲁番地区牛感染巴贝斯虫病的血清学调查

为了解双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫在新疆疫区牛感染的状况,从吐鲁番市周边散养户、和静县部分散养户采集了273份牛(牦牛)血清。采用间接ELISA方法对血清样本进行牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫抗体检测。结果显示:和静县部分散养户被检牦牛血清抗牛巴贝斯虫(B.bovis)抗体阳性率为18.68%(17/91);被检牦牛血清抗双芽巴贝斯虫(B.bigemina)抗体阳性率为9.89%(9/91)。吐鲁番市周边散养户被检奶牛血清抗牛巴贝斯虫(B.bovis)抗体阳性率为15.38%(28/182);被检奶牛血清抗双芽巴贝斯虫(B.bigemina)抗体阳性率为9.34%(17/182)。通过调查发现牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫均有混合感染的现象,其中和静牦牛混合感染率为6.59%(6/91);吐鲁番奶牛混合感染率为8.24%(15/182);不同品种牛均可感染牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫,其感染程度及感染率具有一定的差异。本次试验结果可为有效防治新疆疫区牛梨形虫病提供重要依据。     

蜱传牛巴贝斯虫套式PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、敏感检测牛巴贝斯虫的方法,本研究根据GenBank中登录的牛巴贝斯虫rap-1基因保守区设计2对特异性引物,经反应条件的优化,建立了牛巴贝斯虫套式PCR检测方法。结果显示,该方法可以特异地检测牛巴贝斯虫,而对双芽巴贝斯虫、牛环形泰勒虫和弓形虫的检测均为阴性;该方法的灵敏度可达1.3×10~1拷贝/μL,是牛巴贝斯虫荧光定量PCR检测试剂盒的10倍,是常规PCR的1 000倍。对50只扇头蜱和微小牛蜱DNA进行检测,套式PCR、牛巴贝斯虫荧光定量PCR检测试剂盒和常规PCR的阳性检出率分别为100.0%、72.0%和0。本实验建立的套式PCR检测方法适用于牛巴贝斯虫病的早期诊断和分子流行病学调查,为蜱传牛巴贝斯虫病的防控提供技术支持。     

水牛犊人工感染牛巴贝斯虫试验

利用从牛巴贝斯虫病症区采集的镰形扇头蜱叮咬和皮下接种液氨保存的含虫血两种方法，感染去脾和未去脾犊牛，证实了牛巴贝斯虫可以感染水牛犊并使去脾水牛犊发病，但不能使未去脾水牛犊发病。连续注射氢化泼尼松可收提高去脾水牛犊的红细胞染虫率。本试验还详细观察和探讨了水牛巴贝斯虫病的临床症状、虫体在病牛血液中的消长规律、血液学变化及病理解剖学变化。     

识别牛巴贝斯梨形虫的特异性DNA探针

用质粒ＰｕＮ１２１从墨西哥虫株Ｍ建立牛巴贝斯梨形虫ＤＮＡ的基因族，并克隆于大肠杆上，选择几个与标记的牛巴贝斯梨形虫基因ＤＮＡ杂交的重组质粒，进一步分析，发现ＰＭｕ－Ｂ１敏感性较高，能检测出２５ｐｇ纯净的牛巴贝斯梨形虫ＤＮＡ。１０μｌ感染全血中３００个梨形虫或０．０００２５％虫血症，ＰＭｕ－Ｂ１含有６．０ｋｂ牛巴贝斯梨形虫ＤＮＡ插人物，该插人物不与双芽巴贝斯梨形虫，伊氏锥虫，恶性疟原虫，边缘边虫，微     

人血清用于体外培养牛巴贝斯虫

在牛巴贝斯虫的培养中，使用不同含量人血清和牛血清混合物，如：２０％＋２０％，３０％＋１０％，４０％＋０％，０＋４０％以及１９９培养液。牛巴贝斯虫稳定株接种给小犊牛，在染虫率６％时使用。培养液每隔２４小时更换一次，每间隔２４小时培养液的颜色由鲜红变为深咖啡色，红细胞染虫率的增加在２４－２８小时内最大。同时也观察到红细胞染虫率在１：２稀释明显高于１：１稀释。在培养液Ⅰ中，５０％牛血清被人血清替代，红细     

东方巴贝斯虫的18S rRNA基因的扩增及系统发育研究

利用真核生物18S rRNA基因的PCR通用引物对寄生于中国水牛的巴贝斯虫（已命名为东方巴贝斯虫-BnbPsia orientalis）基因组DNA进行扩增，得到其18S rRNA全基因片段，测序后blast分析表明该虫种属巴贝斯虫无疑。将该基因1700bp长片段序列与GenBank中15种已知巴贝斯虫的相应序列进行比较分析，建立系统发育树。结果表明，东方巴贝斯虫与南非未定种的巴贝斯虫亲缘关系最近，与羊巴贝斯虫亲缘关系较近，与牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的亲缘关系较远。这一结果说明水牛东方巴贝斯虫是一独立种。     

应用镰形扇头蜱及巴贝斯虫病水牛的染虫血感染黄牛试验

从非流行区购进无蜱寄生的健康黄牛５头与水牛犊１头，其中３头成年黄牛（２～８岁）在畜舍内用从流行区水牛身上采得的镰形扇头蜱Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｏｉｄｅｓｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｏｉｄｅｓ成虫，置于牛耳壳内叮咬；１头运至流行区放牧，让蜱上身叮咬；１头黄牛犊（１０年龄）去蜱后２周，用液氮保存的患病水牛染虫血４ｍｌ（４×１０ ８个虫体）皮下注射；另一头去蜱水牛犊亦同时注射相同剂量的染虫血，作为对照。５头黄牛在试验期间其体温、精神、食欲正常，未出现任何临床症状，感染后１０～１２ｄ外周血液中出现少量不典型的牛巴贝斯虫，红细胞染虫率在０．１％以下，持续３～５６消失；对照牛则体温升高（３９．８～４１．１℃），出现贫血、黄疸等症状，红细胞压积（ＰＣＶ）降至２６％，外周血液中出现典型的牛巴贝斯虫，红细胞染虫率（ＰＰＥ）高达１２％。对采用蜱叮咬及注射来自病水牛的染虫血为何不能使黄牛感染发病，文中进行了讨论。     

国产咪唑苯脲对水牛巴贝斯虫病的预防试验

1988年4～9月,在江苏省江宁县水牛巴贝斯虫病流行区,对775头2周岁以上的水牛应用国产咪唑苯脲进行了预防试验,其中415头水牛按2mg/kg体重的剂量肌肉注射咪唑苯脲二盐酸盐溶液作为试验组,360头不进行预防注射作为对照组。结果,在4个月内,试验组有3头发病,发病率为0.72％;对照组有36头发病,发病率为10％;经统计学处理,两组百分率差异极其显著(P<0.01),证明国产咪唑苯脲对水牛巴贝斯虫病有较好预防效果。     

湖北省水牛巴贝斯焦虫病调查研究——Ⅱ.实验感染证实镰形扇头蜱是牛巴贝斯焦虫和双芽巴贝斯焦虫的传播者

自非流行区选购无蜱和无血液原虫寄生的健康水牛4头,其中3头运至流行区放牧,并让蜱上身叮咬以自然感染巴贝斯焦虫病。在此3头水牛身上最早发现的蜱经鉴定为镰形扇头蜱Rhipicephalus haemaphysaloides haemaphysaloides Supino。另一头则在实验室内用采自流行区水牛身上同一种蜱人工感染。所有试验动物在蜱上身后第9～12天出现持续性发热(达40.8℃～41.8℃)和虫血症。血液抹片中虫体经鉴定为牛巴贝斯焦虫Babesia bovis和双芽巴贝斯焦虫B·bigemina,均为混合感染。在3头自然感染水牛中,有2头出现贫血。腹泻、黄疸和血红蛋白尿,这2头牛用贝尼尔治疗后痊愈。另一头未用药而自愈。人工感染水中亦用贝尼尔治疗而痊愈。由本试验得出结论:镰形扇头蜱是湖北省水牛巴贝斯焦虫病的传播者。     

一起牛双芽巴贝斯虫病的诊治

牛巴贝斯虫病是由巴贝斯虫属的原虫寄生于牛的血细胞和网状内皮系统引起的寄生虫病。临床主要特征为高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿。在我国，引起牛巴贝斯虫病的病原体有3种，即双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫。该病的发生呈一定的地区性、季节性。2009年7月23日我县某养牛户饲养黑白花母牛9头，其中4头突然发病，1头死亡，现将诊疗情况报告如下。     

牛巴贝斯虫病的流行病学调查分析

牛巴贝斯虫病是媒介蜱传播的梨形虫纲巴贝斯科巴贝斯属的多种病原体寄生在动物红细胞、网状内皮细胞而所发的血液原虫病,牛巴贝斯虫病会对养牛场造成巨大的经济损失,其发病症状主要以血红蛋白尿、贫血、发热为主,由于当前对牛巴贝斯虫病的预防还没有比较好的实用方法,因此,加强牛巴贝斯虫病初期感染诊断有十分重要的作用。文章以某地区牛巴贝斯虫病感染情况为例,采用牛巴贝斯虫病间接ELISA检测方法,对牛巴贝斯虫病流行病学进行调查分析。     

牛卵形巴贝斯虫的体外培养

本试验研究了长期在液氮或－80℃冷冻保存虫株－牛卵形巴贝斯虫（B.ovata)的体外培养方法，并探讨了培养条件，试验结果表明：液氮内保存2年之久的牛卵形巴贝斯虫809814号虫株，先经过BO－SCID小鼠体内大量增殖后，在完全埋头液和37℃，5％CO2，5％O2，90％N2培养箱内能够快速增殖，连续培养45天，继代9次，B.ovata在BO－RBC－SCID小鼠体内染虫率可达15％以上，体外培养最高染虫率为6．3％，染虫率5％以上红细胞可作诊断用抗原的制备材料或用液氮（或冷冻）继续保存。