海岛棉GbMFT1基因的克隆及表达分析

通过RT-PCR和RACE技术,从新疆海岛棉品种新海14中克隆得到了一个MFT (MOTHER OF FT AND TFL1)类似基因,命名为GbMFT1基因(GenBank登录号为KC513744)。GbMFT1基因的开放阅读框(ORF)为528 bp,编码175个氨基酸的蛋白,含一个磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)结构域。GbMFT1蛋白的羧基端含有MFT蛋白都含有的脯氨酸。系统进化树分析表明GbMFT1编码产物与葡萄、番茄亲缘关系较近,属于同一进化分枝。实时荧光定量PCR分析表明,GbMFT1基因在棉花的不同组织中均有表达,在花瓣中的表达量较高;在纤维发育的不同时期中均有表达,在开花后2 d的胚珠、9 d的纤维中表达量最高。半定量RT-PCR结果表明,GbMFT1基因在刚萌发的种子中表达量高,用不同浓度的ABA处理种子后其表达变化不明显,表明GbMFT1基因的表达不受ABA的调节。     

海岛棉GbMFT2基因能提高烟草的耐盐能力

MOTHER OF FT AND TFL1(MFT)属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidyl ethanolamine-binding protein,PEBP)家族,该家族在被子植物中主要起着促进或抑制开花和控制株型的作用。本课题组前期从海岛棉(Gossypium barbadense)中克隆了一个MFT-like同源基因GbMFT2,发现其在种子中表达量较高,并且受ABA诱导。为了进一步探究该基因的功能,本研究首先检测了200 mmol/L Na Cl胁迫海岛棉0、1 h、3 h、6 h、12 h后基因的表达量,表明在盐诱导1 h GbMFT2基因的表达量最高。然后构建了过量表达载体p35S:GbMFT2,并通过农杆菌介导的叶盘法将其转化到普通烟草(Nicotiana tabacum cv.NC89)中,半定量RT-PCR表明GbMFT2基因在烟草中异位表达成功。利用0、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L和500 mmol/L Na Cl胁迫不同的转基因株系,表明转基因烟草比野生型烟草更耐盐。再分别测量300 mmol/L Na Cl处理前后的野生型烟草和转基因烟草的脯氨酸含量、POD活性,发现处理后的野生型烟草的脯氨酸含量、POD活性均明显降低,而转基因烟草株系中的脯氨酸含量、POD活性均有明显的提升。研究结果表明,GbMFT2基因能够响应盐胁迫,并增加烟草的耐盐性。本研究可为研究植物MFT-like基因的功能提供了新思路,也为进一步解析棉花发育基因的功能提供了研究基础。     

甘蔗Ca~(2+)/H~+反向运转体基因的克隆与表达分析

CAX(Ca~(2+)/H~+antiporter)是植物细胞膜Ca~(2+)主动运输体系的一个大类。本研究以高粱的CAX1基因(GenBank登录号为XM_002441593)为探针,利用电子克隆并结合RT-PCR技术,获得甘蔗CAX1基因的1条cDNA序列,命名为Sc CAX1(GenBank登录号为KT799799)。生物信息学分析显示,ScCAX1基因全长784 bp,包含1个645 bp的开放阅读框,编码1个214个氨基酸的蛋白质。ScCAX1蛋白被定位于叶绿体类囊体膜,为稳定的疏水性蛋白,不存在信号肽。蛋白二级结构元件多为α-螺旋,具有1个Na_Ca_ex superfamily。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗ScCAX1基因的表达具有组织特异性,在各组织中均表达,但在茎中表达量最低,叶中的表达量最高。在PEG、NaCl、SA、ABA和Me JA胁迫过程中,ScCAX1基因的表达均受到调控。其中ABA、SA和PEG胁迫下表达量上调,均在胁迫24 h达到最大值。SA胁迫24 h的表达量为对照的5.47倍,而ABA胁迫24 h的表达量为对照的3.5倍。NaCl胁迫6 h的表达量达最大值,为对照的2.14倍。推测ScCAX1基因能够响应逆境胁迫,其表达可能与甘蔗的抗盐、抗渗透胁迫性状有关。     

GmRACK1参与H2O2和ABA对大豆种子萌发的调节机理研究

活化C激酶1受体(RACK 1)是WD(Trp-Asp)重复序列蛋白家族中的一员,参与多种信号通路。在本研究中,通过构建一系列过表达或抑制表达的转基因大豆株系,研究大豆RACK1基因(GmRACK1)在控制种子萌发中的作用及其分子机制。结果表明,GmRACK1过表达与对照种子萌发速率显著高于抑制表达种子萌发速率,外源ABA对所有基因型种子萌发有抑制作用。抑制ABA的生物合成对大豆所有基因型发芽率没有促进作用,而抑制ABA的分解代谢,显著降低其发芽率;外源H₂O₂处理几乎完全恢复了ABA对过表达及对照种子萌发的抑制作用,而缓解ABA对Ris种子的抑制作用。定量分析表明,与野生型或过表达GmRACK1株系相比,GmRACK1抑制表达株系的内源ABA水平显著升高,而H₂O₂水平显著降低。因此,GmRACK1通过控制内源ABA和H₂O₂水平及其相互作用来调节种子萌发。     

苎麻ACC合酶基因(BnACS1)的克隆和表达分析

根据苎麻转录组测序中的ACS基因片段, 利用RT-PCR结合RACE技术从湘苎3号中克隆了该基因的全长cDNA序列, 命名为BnACS1, 在GenBank中的登录号为JQ970520。该基因的cDNA序列全长为1 674 bp, 其开放阅读框长1 470 bp, 编码489个氨基酸多肽, 预测其分子量和等电点分别为54.55 kD和6.37, 与苹果(AB034993)、枇杷(GQ370520)、苦瓜(AF248734)、牡丹(DQ337250)、烟草(AY426755)和胡杨(AB033502) ACS基因核苷酸序列的相似性分别为74%、74%、72%、71%、70%和70%, 氨基酸序列的相似性分别为75%、74%、71%、71%、70%和74%。半定量RT-PCR分析表明, BnACS1基因在根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达, 其中在根和雄花中表达较高, 在茎中表达最低。荧光定量PCR分析表明, BnACS1受ABA和干旱的诱导表达上调, 不受高盐诱导表达。     

紫苏PfDGAT2基因生物信息学及表达特性分析

为研究二酯酰甘油酰基转移酶2(PfDGAT2)在紫苏种子油脂合成过程中的调控作用,对紫苏DGAT2基因及其编码的蛋白质进行了详细的生物信息学分析,并研究了该基因在不同紫苏品种中的表达特性。结果表明,PfDGAT2基因c DNA全长1 249 bp,共编码329个氨基酸;DGAT2蛋白的等电点为9.46,属于碱性蛋白质;二级结构预测表明,紫苏DGAT2蛋白的主要结构元件是无规则卷曲(34.65%)和α-螺旋(30.09%);系统进化树分析表明,紫苏与芝麻和烟草的亲缘关系较近,与油橄榄的亲缘关系较远。通过研究PfDGAT2基因在含油量不同的2个紫苏品种种子发育的不同时期表达特性,结果表明,该基因在开花后30 d形成的种子中表达量最高,但是二者又具有一定差异,晋紫苏1号(含油量46.88%)表达量为开花后10 d的1.63倍,并紫苏1号(含油量35.60%)为0.75倍,因此,推测DGAT2在紫苏TAG生物合成中起重要调控作用。     

大豆GmTINY1基因的克隆与表达分析

采用基因芯片技术,从大豆中鉴定了一个荚优势表达基因。利用生物信息学的方法,拼接了该基因的全长序列,并通过RT-PCR克隆了该基因。Blast检索分析表明,该基因编码一个具有AP2结构域的转录因子,且与拟南芥DREB类蛋白TINY的氨基酸相似度最高,将该基因命名为GmTINY1。GmTINY1包含一个735 bp的开放阅读框,编码244个氨基酸残基。GmTINY1与拟南芥TINY和TINY2蛋白的相似度分别为59%与62%。系统发生分析表明,GmTINY1、TINY和TINY2位于一个分支,且同属于DREB亚家族。实时定量RT-PCR检测表明,GmTINY1基因在荚中高丰度表达,在花中的表达量也较高,在根中的表达量较低,而在叶片中未检测到表达。基因芯片信息分析结果表明,GmTINY1在种子发育的子叶期的种脐部分高丰度表达。由此推论,GmTINY1基因在大豆生殖器官发育中可能发挥调控作用,可能与种子发育过程中种脐的形成有关。     

一个棉花类受体蛋白激酶基因的克隆与表达分析

 利用简并引物扩增、染色体步移以及RT-PCR的方法,分离了棉花的一个类受体蛋白激酶基因的全长序列。序列分析表明,该基因没有内含子,开放读码框的长度为2964 bp,编码的多肽序列含有988个氨基酸并与拟南芥控制花器官脱落的基因HAESA-like2具有60%左右的相似性,将该基因命名为GRLK5。半定量RT-PCR分析发现GRLK5在种子、茎皮、根和纤维中的表达量较高,并且受ABA的诱导表达。将GRLK5整合到植物表达载体pCAMBIA2301中,构建植物过量表达载体,通过农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,PCR检测证明目的基因已经整合到烟草基因组中。     

大豆KTI1基因表达方式分析及其启动子预测

为明确大豆胰蛋白酶抑制剂基因(KTI1)在不同逆境、ABA条件下及大豆不同组织中的表达方式,本研究采用实时荧光定量PCR技术检测,结果表明KTI1基因受低温、盐、干旱和ABA诱导,分别在处理10、5、24和1 h时获得诱导最高值,相对表达量分别是未处理的288.65,274.35,136.04和56.48倍;KTI1基因在大豆种子中的表达量相对较高,叶中的表达量为1时,种子中的表达量为8.70。根据大豆基因组序列,扩增KTI1基因ATG上游启动子序列1 831 bp;生物信息学预测分析表明启动子中存在多种常出现在逆境胁迫诱导型启动子中的顺式调控元件,推测大豆KTI1基因启动子可能是受低温、盐、干旱和ABA诱导的诱导型启动子。本研究为进一步研究和应用大豆KTI1基因及其启动子提供理论基础。     

菊花MADS-box基因的克隆与表达载体构建

为了给菊花CmFUL基因功能鉴定与遗传改良奠定基础,采用RT-PCR法从菊花叶片中克隆出1个MADSboxA类基因的编码区序列,命名为CmFUL(Gen Bank登录号KT894379)。CmFUL基因编码区ORF片段长度为741 bp,编码246个氨基酸。CmFUL蛋白属于亲水性蛋白,预测该蛋白内含12个磷酸化位点和2个潜在的N-糖基化位点。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,CmFUL蛋白与CMD41蛋白的相似性为95.6%,同属于AP1/FUL亚家族的FUL-like进化枝。实时荧光定量PCR分析表明,CmFUL基因在花期不同组织中均有表达,但表达丰度不一。在花蕾中表达量最高,其次是管状花,根和舌状花中痕量表达;同一朵花中管状花的表达量约为舌状花中的12倍。分析认为,CmFUL可能在促进开花及子房建成中起重要作用。将CmFUL基因连接到p CAMBIA1300载体上,成功构建了高效植物表达载体。     

亚洲棉和雷蒙德氏棉PEBP家族基因的鉴定及该家族基因在陆地棉组织中表达分析

磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidyl ethanolamine-binding proteins,PEBP)基因家族广泛存在于真核生物中,在被子植物中主要起着促进或抑制开花和控制株型的作用。利用亚洲棉(Gossypium arboreum,A2)和雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii,D5)的基因组数据库,分别搜索到8个棉花PEBP同源基因,都包含4个外显子和3个内含子,编码的蛋白都存在PEBP家族的保守基序和关键氨基酸位点,表明二倍体棉花中至少存在8个PEBP家族基因。进化分析表明,8个PEBP基因分属于3个亚家族,含FLOWERING LOCUS T(FT)-like亚家族1个、TERMINAL FLOWER 1(TFL1)-like亚家族5个(包括3个TFL1和2个BFT)、MOTHER OF FT AND TFL1(MFT)-like亚家族2个。实时荧光定量PCR分析陆地棉(Gossypium hirsutum)8个PEBP基因在根、茎、叶、幼苗顶端分生组织、花、胚珠和25 d的纤维组织中的表达,表明FT1在叶片中表达量最高,其次在纤维、胚珠和花中;MFT1在各组织中均表达,但在纤维中表达量最高,其次是花和叶片中,而MFT2以在叶片中表达为主;TFL1a、TFL1b和TFL1c均在根中表达量最高,但TFL1c在叶片、花和胚珠中也有相对较高的表达;BFT1和BFT2在叶片中表达量最高,但除幼苗顶端分生组织外,BFT1在其他各组织中的表达明显高于BFT2。这些结果表明,PEBP家族基因在棉花的生长发育中可能具有不同的功能。     

甘蔗ABA信号转导关键酶SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶(SnRK)是植物体内ABA信号转导途径的关键调控酶, 在植物的抗逆境生长过程中发挥着重要的作用。本研究通过RT-PCR和RACE-PCR技术克隆出编码甘蔗SnRK2蛋白的基因SoSnRK2.1。该基因cDNA序列全长为1385 bp, 包含一个1002 bp的开放阅读框(ORF)。根据氨基酸序列预测SoSnRK2.1基因编码333个氨基酸残基, 与其他高等植物中相关蛋白的氨基酸具有高度的相似性, 尤其是与禾本科的玉米和水稻。构建该基因的原核表达载体pET-SoSnRK2.1, 在IPTG诱导下可得到38 kD 左右的蛋白, 与理论值一致。实时荧光定量PCR分析表明, SoSnRK2.1基因在ABA、干旱(PEG)+ABA、干旱(PEG)、NaCl、低温(4℃)和H₂O₂外源胁迫下均呈诱导表达的趋势。推测该基因参与调控干旱、高盐和低温等胁迫过程, 在甘蔗抗逆境胁迫中起重要作用。     

玉米非生物逆境响应基因ZmASK1的克隆及表达特性分析

类Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因在植物发育和逆境应答中起着十分重要的作用。通过RT-PCR方法从玉米中克隆了一个与Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因同源的全长cDNA, 命名为ZmASK1(abiotic stress-induced kinase)(GenBank accession No., AY722707)。推测ZmASK1蛋白含有426个氨基酸, 分子量为48.5 kD, 等电点为8.7。半定量RT-PCR分析表明, ZmASK1可以被甘露醇、高盐和脱落酸(ABA)诱导。另外, 在不同的组织中, ZmASK1的表达模式也不一样, 在子房中的表达量最高。这些结果表明, ZmASK1可能在植物逆境反应及生殖生育过程中起多重作用。本文是玉米类Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因参与胁迫和发育过程的首次报道。     

玉米光周期敏感类Hd6基因的克隆和实时定量表达分析

水稻Hd6基因在调节水稻光周期敏感中起重要作用。本研究以热带玉米自交系CML288为材料, 利用同源基因克隆法结合3¢RACE技术克隆了与水稻Hd6基因同源的玉米类Hd6基因。该基因序列中999 bp的开放阅读框可编码332个氨基酸。BLAST分析发现, 该基因与玉米中编码蛋白激酶CK2的一个基因高度同源, 所推测的氨基酸序列包含2个CK2活性区域, 1个N末端区域, 1个ATP结合位点和1个丝氨酸/ 苏氨酸蛋白质激酶活性位点,与玉米、小麦、水稻和拟南芥的CK2氨基酸序列也有较高的同源性。建立了SYBR GREEN法实时荧光定量RT-PCR表达分析系统, 研究了不同光周期处理下类Hd6基因在光周期敏感自交系CML288茎尖和叶片中的表达。结果发现, 该基因在茎尖和叶片中均有表达。在短日条件下, 该基因在6~8叶期茎尖中的表达量存在明显差异, 在光周期敏感的7叶期出现表达高峰, 在叶片中的表达量均低于茎尖。在长日条件下, 该基因在茎尖中6叶期表达量较低, 在光周期敏感的9叶期在叶片中高量表达。由此可推测, 该基因与玉米光周期敏感密切相关, 可能在光周期敏感调节过程中发挥一定的作用。     

花生中DREB类转录因子PNDREB1的克隆及鉴定

脱水响应元件结合因子(DREB)是一类对多个抗逆相关基因表达起调控作用的植物特有的转录因子,在植物抗逆能力综合改良方面具有重要作用。本研究通过筛选花生未成熟种子的cDNA文库,分离到一个DREB类基因——PNDREB1(FM955398)。该基因序列长度为687 bp,推测编码蛋白含有229个氨基酸残基,相对分子量为24.7 kD,理论等电点为5.97,与其他物种中该类转录因子序列同源性较高。利用酵母单杂交系统,对花生PNDREB1与DRE元件的特异识别和结合能力及其C-末端转录激活活性进行检测,显示,转入含有该基因及阳性对照基因的载体均可使酵母菌株正常生长,且具有显色反应,而转入空载体的酵母菌株不能生长,证明基因PNDREB1中的AP2结构域具有和DRE元件特异性结合的能力;同时,只有转入含有该基因C-末端片段及阳性对照基因的载体可使酵母菌株正常生长,并具有显色反应,而转入空载体的酵母菌株不能生长,说明其C-末端片段具有转录激活活性,该基因为DREB类转录因子。基因表达模式分析显示,PNDREB1为组成型表达,且被低温强烈、迅速诱导表达,并对干旱胁迫也有一定程度的响应,但对高盐和ABA处理没有响应。     

玉米非生物逆境响应基因ZmASK1的克隆及表达特性分析

类Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因在植物发育和逆境应答中起着十分重要的作用。通过RT-PCR方法从玉米中克隆了一个与Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因同源的全长cDNA, 命名为ZmASK1(abiotic stress-induced kinase)(GenBank accession No., AY722707)。推测ZmASK1蛋白含有426个氨基酸, 分子量为48.5 kD, 等电点为8.7。半定量RT-PCR分析表明, ZmASK1可以被甘露醇、高盐和脱落酸(ABA)诱导。另外, 在不同的组织中, ZmASK1的表达模式也不一样, 在子房中的表达量最高。这些结果表明, ZmASK1可能在植物逆境反应及生殖生育过程中起多重作用。本文是玉米类Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因参与胁迫和发育过程的首次报道。     

碱茅(Puccinellia tenuiflora)Put-R40g3基因的分离及其与逆境的应答

从碱茅(Puccinellia tenuiflora)cDNA文库中分离得到Put-R40g3基因(登录号:AB465547).克隆的cDNA全长为588 bp,其编码的蛋白质共195个氨基酸,与水稻,小麦和拟南芥的R40g3蛋白的氨基酸序列有较高的同源性.对经逆境处理的碱茅幼苗根、叶中该基因的表达分析结果表明,碱茅中Put-R40g3基因的表达有被ABA、盐和干旱诱导的趋势.Put-R40g3蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)融合在酵母细胞表达的蛋白质定位研究结果显示了Put-R40g3蛋白存在于细胞质中.同时Put-R40g3基因在酵母中表达,酵母在盐、干旱及氧化逆境条件下提高了对逆境的适应能力.这些结果暗示了Put-R40g3基因是一个与逆境相关的基因.     

河北杨脱水素基因(Phdhn1)的克隆与胁迫表达分析

为了鉴定河北杨中的脱水素基因并研究其在逆境胁迫中的表达规律,以初步分析脱水素基因在河北杨逆境胁迫中的调控功能,在实验室前期工作的基础上设计引物,通过PCR方法扩增河北杨cDNA文库获取脱水素基因,并通过半定量RT-PCR方法研究其在逆境中的表达情况。结果表明,河北杨脱水素全长基因856 bp,共编码227个氨基酸。同源性分析表明,河北杨中的脱水素基因与已知的其他杨树脱水素高度同源,因此将该基因定名为Phdhn1。半定量RT-PCR结果表明在干旱、低温、高温、高盐及ABA溶液不同时间段(0、0.5、1、2、5、10、24 h)的胁迫下,河北杨Phdhn1在干旱、ABA以及低温胁迫下均出现表达差异。该研究初步阐述了Phdhn1的逆境表达模式,说明了Phdhn1在河北杨逆境胁迫中起到的重要作用。     

高粱中SbDREB2基因的克隆与表达分析

干旱应答元件结合蛋白(DREB)在植物非生物逆境胁迫中调节下游一系列抗逆基因的表达。本研究利用电子克隆和RT-PCR方法从高粱中克隆到1个DREB类基因SbDREB2,该基因ORF 789 bp,推测编码蛋白含262个氨基酸残基,相对分子质量28.6 kD,理论等电点为5.52,在DNA序列内包含1个740 bp的内含子,符合GT-AG剪接规则。氨基酸序列分析表明,该蛋白在82~145区含有DREB类转录因子家族特有的AP2保守结构域,与玉米DREB2A及水稻DREB1蛋白相似度分别为84%和69%。成功构建了原核表达载体pET28a-SbDREB2,经IPTG诱导获得32.5 kD左右蛋白,与理论值一致。Real-time PCR表达特性分析显示,该基因为组成型表达,在根、茎、叶中均表达,根中表达量约是茎中的2.5倍;受干旱、高盐和外源ABA的强烈诱导,但对低温几乎没有响应。