甘蔗Na~+/H~+逆转运蛋白基因的克隆与表达分析

Na~+/H~+逆向转运蛋白基因SOS1(salt overly sensitive 1)是植物耐盐性的必需基因之一,在植物抵御盐胁迫过程中发挥十分重要的作用。本研究以小麦EST序列KJ563230为探针,利用电子克隆技术结合RT-PCR,获得一条甘蔗SOS1基因的cDNA序列,命名为ScSOS1(GenBank登录号为KT003285)。序列分析结果表明,该基因全长1403 bp,包含一个1272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸的蛋白质。ScSOS1蛋白的相对分子质量为47.6 kD,理论等电点(pI)为9.12。氨基酸序列分析表明,ScSOS1蛋白具有一个CAP-ED superfamily结构域。生物信息学预测显示,ScSOS1的编码蛋白为亲水性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与中间代谢。实时荧光定量PCR分析表明,ScSOS1基因的表达具有组织特异性,在甘蔗叶鞘、蔗皮、蔗髓、侧芽和根中均有表达,其中在叶鞘中的表达量最高,根中的表达量最低。此外在NaCl、PEG、ABA、SA和MeJA的胁迫过程中,该基因表达均受到调控,其中受NaCl和PEG诱导后上调表达,均在24 h表达量达最高,分别约为对照组的1.5倍和4.0倍。推测该基因的表达与甘蔗耐盐性和抗渗透胁迫有关。     

甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK(calcineurin B-like-interacting protein kinase)是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫(干旱、高盐、ABA等)的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因(EU957447.1,2247 bp)核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长c DNA序列(Gen Bank登录号为KM114052)。序列分析结果表明,甘蔗Sc CIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,91~1631 bp),编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域(Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily)。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、Na Cl、ABA、SA和Me JA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。     

甘蔗S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(ScSAM)的克隆及表达

利用RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种新台糖22号(ROC 22)中克隆获得SAM基因的cDNA序列,命名为ScSAM,GenBank登录号为KC172558。用生物信息学方法预测分析其序列,cDNA全长1466 bp,含有1个1191 bp的完整开放阅读框(ORF),编码396个氨基酸,与高粱和玉米等植物的SAM蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,甘蔗ScSAM与高粱的SAM蛋白亲缘关系较近。Real-time PCR分析表明ScSAM为组成型表达,在根中的表达量最高,是叶中表达量的3.6倍。其在黑穗病菌胁迫和低温(4℃)、聚乙二醇(PEG)、NaCl非生物胁迫下均被诱导表达,但表达模式不同;在H₂O₂胁迫下其表达被抑制。推测其可能参与甘蔗抗黑穗病过程,且在甘蔗抗寒、抗旱、抗盐和抗氧化等胁迫过程中也起某种作用。     

甘蔗磷脂酰肌醇转运蛋白基因ScSEC14响应干旱和盐胁迫

Sec14-like磷脂酰肌醇转运蛋白(Sec14-like phosphatidylinositol transfer proteins, PITPs), 广泛存在于真核生物细胞中, 参与肌醇磷酸代谢、膜运输、极性生长、信号转导、逆境胁迫等多种重要的生命过程。甘蔗中响应干旱和盐胁迫的Sec14-like基因尚未见报道。本研究从甘蔗受黑穗病胁迫的转录组数据库中获得一条SEC14基因序列, 并利用RT-PCR技术克隆得到甘蔗SEC14基因cDNA全长序列, 命名为ScSEC14 (GenBank登录号为MG571103)。生物信息学分析显示, ScSEC14基因全长1617 bp, 包含一个1008 bp的完整开放阅读框, 编码335个氨基酸; ScSEC14为不稳定的亲水性蛋白, 不存在信号肽; 蛋白二级结构元件多为α-螺旋, 具有典型的SEC14结构域和CRAL_TRIO_N结构域。此外, 系统进化树分析揭示, 该蛋白属于Sec14-like蛋白家族的SSH (soybean Sec14 homolog group)亚家族。亚细胞定位结果表明, ScSEC14蛋白主要定位于细胞膜。实时荧光定量PCR分析发现, ScSEC14基因在甘蔗中组成型表达, 在蔗皮中的表达量最低, 蔗叶中的表达量最高, 约为蔗皮的4.9倍; 该基因在PEG、NaCl、CaCl₂和水杨酸(SA)胁迫下的表达量均上调。因此, 甘蔗ScSEC14基因可能参与Ca ²⁺和SA介导的抗逆信号通路, 积极响应逆境胁迫, 尤其调节了干旱和高盐环境下的抗逆性。     

甘蔗CDK基因的cDNA全长克隆与表达分析

植物细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与周期蛋白(Cyclins)协同作用,是重要的细胞周期性调控因子。本研究从甘蔗受花叶病毒侵染的转录组数据库中获得一条与高粱(Sorghum bicolor)CDK基因(Gen Bank登录号为XP_002466536.1)高度同源的Unigene序列,通过RT-PCR扩增获得长度为1799 bp的甘蔗Sc CDK基因(Gen Bank登录号为KR258796)。序列分析显示Sc CDK基因含一个完整的开放阅读框(65~1603 bp),编码512个氨基酸,且具有CDK典型保守结构域,如ATP结合位点、磷酸结合位点及活化环A-loop。此外,生物信息学预测显示该基因编码的蛋白定位于细胞核,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与蛋白翻译。实时荧光定量PCR分析表明,Sc CDK基因的表达具有组织特异性,其在蔗芽上的表达量最高,其次是在蔗肉、蔗根、叶鞘和蔗皮中;在PEG、Na Cl和ABA的胁迫诱导过程中,Sc CDK均表现上调作用,且受ABA胁迫后表达量最高,约为对照组的1.9倍。推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关,同时受ABA的诱导,参与细胞周期分裂。     

茶树bZIP转录因子基因CsbZIP1的克隆与表达定位

碱性亮氨酸拉链蛋白(bZIP)作为真核生物中分布最广、最保守的一类转录因子,参与多种生物学过程,尤其在植物抵御各种逆境胁迫中有重要作用。采用RACE和RT-PCR技术克隆到茶树bZIP转录因子基因全长cDNA序列,命名为CsbZIP1(GenBank登录号为JX050148.1)。该基因cDNA全长1515 bp,包含813 bp的完整开放阅读框(ORF),编码270个氨基酸,预测分子量29.484 kD;含有bZIP家族典型的BRLZ结构域碱性结构域和亮氨酸拉链,属于B_-zip1家族;系统发育树分析显示CsbZIP1属于bZIP转录因子F亚家族;亚细胞定位结果表明CsbZIP1主要定位于细胞核;qRT-PCR分析表明,4℃低温和NaCl盐胁迫处理均能诱导CsbZIP1的表达,表达量变化趋势都是随着胁迫时间先逐渐升高,到24 h时降低,ABA胁迫处理24 h抑制CsbZIP1的表达。推测CsbZIP1与茶树低温、盐等逆境胁迫密切相关。     

甘蔗亲免素基因ScFKBP12-1的克隆及表达特性分析

FKBP (FK506 binding proteins)是一类能与免疫抑制剂他克莫司(tacrolimus, FK506)和雷帕霉素(rapamycin, RAPA)特异结合的受体蛋白,以基因家族的形式存在于植物中并参与多种生物进程,是植物亲免素蛋白的成员。本研究通过甘蔗(Saccharum spp. complex)茎cDNA文库测序获得一条亲免素全长基因ScFKBP12-1 (登录号:MN242814)。ScFKBP12-1 cDNA序列全长696 bp,开放读码框长339 bp,共编码112个氨基酸。生物信息学分析显示,ScFKBP12-1推导蛋白含有一个FKBP类型的肽脯氨酰顺反异构酶催化结构域,是定位于细胞质的稳定亲水性蛋白,分子量为12.20 kD。组织特异性表达分析表明,ScFKBP12-1基因在甘蔗根中的相对表达量显著高于其在叶、蔗茎髓部、蔗茎表皮和腋芽中的表达水平。定量PCR结果显示,甘蔗小苗中ScFKBP12-1对RAPA (5μmol/L)的处理不敏感,提示了ScFKBP12失去与RAPA绑定的能力。定量PCR结果进一步显示,ScFKBP12-1的表达水平受PEG (25%)和MeJA (100μmol/L)的诱导显著上调,在处理前期就分别上调为对照的2.75和3.11倍,并在处理周期内分别维持在高于对照1.87和2.00倍的水平。此外,该基因的表达还受到低温4℃,Na Cl (250 mmol/L)和SA (5 mmol/L)处理的诱导,分别在处理24 h、48 h和3 h时上调表达。以上结果提示了ScFKBP12-1参与了甘蔗对外源激素(MeJA和SA)、低温、高盐和PEG模拟干旱胁迫等逆境的应答过程,其功能可能与甘蔗响应渗透胁迫密切相关,并受MeJA信号的正向调控。     

甘蔗ABA信号转导关键酶SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶(SnRK)是植物体内ABA信号转导途径的关键调控酶, 在植物的抗逆境生长过程中发挥着重要的作用。本研究通过RT-PCR和RACE-PCR技术克隆出编码甘蔗SnRK2蛋白的基因SoSnRK2.1。该基因cDNA序列全长为1385 bp, 包含一个1002 bp的开放阅读框(ORF)。根据氨基酸序列预测SoSnRK2.1基因编码333个氨基酸残基, 与其他高等植物中相关蛋白的氨基酸具有高度的相似性, 尤其是与禾本科的玉米和水稻。构建该基因的原核表达载体pET-SoSnRK2.1, 在IPTG诱导下可得到38 kD 左右的蛋白, 与理论值一致。实时荧光定量PCR分析表明, SoSnRK2.1基因在ABA、干旱(PEG)+ABA、干旱(PEG)、NaCl、低温(4℃)和H₂O₂外源胁迫下均呈诱导表达的趋势。推测该基因参与调控干旱、高盐和低温等胁迫过程, 在甘蔗抗逆境胁迫中起重要作用。     

棉花多胺氧化酶基因(GhPAO_2)的克隆及非生物胁迫下的表达分析

本研究以拟南芥多氨氧化酶(AtPAO2)为探针,在雷蒙德氏棉基因组数据库中获得同源基因并设计引物,利用RT-PCR技术克隆PAO基因,分离一个新的陆地棉PAO基因命名为GhPAO2。该基因cDNA全长为2 237 bp,具有一个1473 bp的开放阅读框,编码490个氨基酸残基,预测该基因蛋白质分子量为54.41 kD,等电点为5.69。利用Real-time PCR对该基因在不同组织和多种非生物胁迫处理进行表达分析,结果表明:GhPAO2基因主要在棉花花瓣和叶中表达;不同胁迫处理下GhPAO2基因表达量均发生显著变化,其中低温处理和20%PEG处理后基因表达量迅速上升并在1 h时表达量达到最高,200 mmol/L NaCl和1 mmol/L ABA处理则在24 h时表达量达到最高,表明GhPAO2基因受低温、PEG、Na Cl和ABA诱导表达,可能在棉花抵御非生物胁迫过程中发挥重要作用。     

棉花精氨酸酶基因GhARG1 cDNA的克隆与表达分析

为了深入研究棉花精氨酸酶基因对非生物胁迫的响应以及生理功能,利用电子克隆和RT-PCR技术从棉花中获得了精氨酸酶ORF序列Gh ARG1,盐渍、PEG6000胁迫及ABA、SA和MeJA处理棉花幼苗,并原核表达棉花精氨酸酶基因。生物信息学分析表明,其ORF序列长度为1 023 bp,编码340个氨基酸,具有典型的精氨酸酶保守结构域。q RT-PCR技术分析表明,在叶片中该基因转录水平上受盐渍、PEG6000胁迫及ABA、SA处理的诱导,而对MeJA下调其表达。将Gh ARG1完整的编码序列融合到原核表达载体p Cold-TF中,经过IPTG诱导及SDS-PAGE检测表明,Gh ARG1编码产物的分子量约为37 ku,与预期相符。p Cold-Gh ARG1重组菌粗酶液中精氨酸酶活性是对照菌的6倍。研究表明,棉花内源性精氨酸酶基因Gh ARG1可能通过ABA、SA信号途径参与棉花对盐渍和干旱胁迫的响应,且其克隆表达产物具有精氨酸酶活性,为开展其生理功能研究奠定了基础。     

盐胁迫条件下外源Ca2+对蚕豆气孔运动及质膜K+通道的调控

研究了Ca²⁺ 对NaCl胁迫下蚕豆气孔运动及质膜K+通道的影响。结果表明,100 mmol L^-1 NaCl可明显诱导气孔开放,该现象可被10 mmol L^-1 CaCl₂ 显著抑制。为探讨盐胁迫下Ca²⁺对K⁺和Na⁺跨膜运输的调控机制,我们利用膜片钳技术记录全细胞K⁺ 电流发现,在100 mmol L^-1 NaCl胁迫下,加入10 mmol L^-1 CaCl₂胞外处理,显著抑制质膜K+内向及外向通道电流,这种抑制可被1 mmol L^-1 La³⁺ (Ca²⁺通道抑制剂)缓解。非盐胁迫下,10 mmol L^-1 CaCl₂ 胞外处理也能显著抑制质膜内向K⁺通道,但明显激活其外向通道,加入1 mmol L^-1 La³⁺并不能被缓解。用H₂O₂专一的荧光探针二氯荧光素二乙酸酯(H2DCF-DA)单细胞分析保卫细胞内H₂O₂含量变化显示,在100 mmol L^-1 NaCl盐胁迫下,10 mmol L^-1 CaCl₂ 处理明显诱导H₂O₂在保卫细胞中积累;100 mmol L^-1 NaCl和10 mmol L^-1 CaCl₂单独处理并不能诱导H₂O₂积累。推测Ca²⁺在盐胁迫下可能先诱导H₂O₂在胞内积累,进而激活质膜Ca²⁺通道,迅速提高胞内Ca²⁺浓度以抑制Na⁺通过质膜K⁺通道跨膜内流,同时调节Na⁺外流,两种效应共同作用促使气孔关闭,减少盐胁迫下水分的过度散失。上述结果将为Ca²⁺调控作物抗盐机制研究提供新的思路。     

水稻WRKY19基因启动子功能研究初报

利用已获得的水稻WRKY19基因启动子(OsW19p::GUS)的转基因植株进行研究，分析了OsW19p在T1代苗期时的诱导表达特性，GUS荧光测定结果表明：OsW19p的表达可被ABA(100 μmol/L)、SA(500 μmol/L)、高温(42℃)、低温(5℃)和伤处理增强；被2,4-D(1μmol/L)、NaCl(200 mmol/L)和PEG4000(25%)处理抑制；IAA(5 μmol/L)、MeJA(100 μmol/L)和紫外线照射处理对OsW19p的表达几乎没有影响。OsW19p在转基因植株根中的表达水平高于35s，但在叶片中低于35s。OsW19p在转基因水稻扬花期茎部中表达水平最高，其次是花、叶鞘和叶片，在根部表达水平最低。     

甘蔗捕光叶绿素a/b 结合蛋白基因ScLhca3 的克隆及表达

捕光叶绿素a/b结合蛋白是植物光系统I (photosystem I, PSI)中与色素分子结合的膜蛋白, 由Lhca基因家族编码, 主要参与光合作用中光能的捕获与传递。本研究对甘蔗叶片cDNA文库测序, 获得甘蔗PSI中Lhca3基因的cDNA序列, 命名为ScLhca3 (GenBank登录号为KU215669)。生物信息学分析表明, ScLhca3的开放读码框(opening reading frame, ORF)长度为804 bp, 编码267个氨基酸, 分子量为28.91 kD, 等电点为8.96; ScLhca3被定位于叶绿体, 无信号肽, 存在3个明显的跨膜区域, 含有典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域(chlorophyll a/b binding domain), 为亲水性非分泌蛋白。多序列比对和进化分析表明, ScLhca3在不同物种间具有较强的保守性, 具有种属特性。构建原核表达载体pGEX-6P-1-ScLhca3, 通过IPTG诱导表明, ScLhca3蛋白与预测大小一致。亚细胞定位试验显示, ScLhca3与报告基因GFP的融合蛋白定位于叶绿体中。实时定量PCR分析表明, ScLhca3在成熟叶片中的相对表达量最高, 根中几乎不表达, 具有明显的组织特异性; 在CdCl₂、ABA和H₂O₂外源胁迫下, ScLhca3均上调表达; 在黑暗、NaCl和PEG胁迫下则下调表达。     

过表达谷子液泡H~+-ATPase E亚基基因在拟南芥中的耐盐性

V-H+-ATPase在植物生长、发育和胁迫响应等生物学过程中发挥重要作用。本研究通过序列比对,从谷子中克隆到V-H+-ATPase E亚基基因Si VHA-E。进化树分析显示,Si VHA-E基因在进化上属于E1/E3亚族,与玉米V-H+-ATPase E亚基基因Zm VHA-EL亲缘关系较近。表达谱分析结果显示,Si VHA-E在高盐、茉莉酸甲酯(Me JA)、水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)处理下表达上调,在低温和低氮处理下表达下调。亚细胞定位分析表明Si VHA-E定位于液泡膜上。遗传转化拟南芥的耐盐性鉴定表明,在盐处理条件下,转基因株系的种子萌发率、幼苗主根长、植株鲜重及存活率显著高于野生型的。与野生型拟南芥植株相比,Si VHA-E过表达植株体内Na+含量减少,体内相对含水量提高。此外,ABA萌发试验结果显示,在种子萌发后期,Si VHA-E过表达植株对ABA更加敏感。研究表明,谷子Si VHA-E可以显著提高拟南芥耐盐性,这可能与其正向调控ABA信号途径以及减少植株体内Na+积累和水分散失有关。     

CaM对渗透胁迫下小麦幼苗ABA合成的介导作用研究

ABA作为干旱信号物质在植物抗逆生理反应过程中起着至关重要的作用,揭示ABA合成及其信号转导机制对于探明植物干旱信息的感受机制尤为重要。通过外使CaM拮抗剂TFP、ABA以及分根试验,研究了渗透胁迫下小麦幼苗根系和叶片中ABA和CaM含量和时间的变化。渗透胁迫均促进根系和叶片ABA和CaM含量不同程度地提高,根系ABA含量峰值出现的时间早于叶片,而CaM峰值出现的时间晚于叶片。但根系和叶片ABA峰值均不晚于CaM。不同浓度TFP和ABA处理都能提高根系和叶片ABA和CaM含量,与渗透胁迫相比,ABA呈现先升高后降低趋势,且最大值出现的时间类似,但CaM呈持续上升趋势。TFP处理抑制根系CaM含量增加,而对叶片有促进效应。ABA处理呈现浓度效应。与全根胁迫相比,分根胁迫对胁迫根系ABA含量影响不明显,但与正常对照相比,显著提高了未胁迫部分根系ABA含量,但二者峰值出现的时间分别滞后6和18 h;叶片ABA和CaM含量也相应提高,且最大值滞后12 h。CaM可能未参与渗透胁迫下ABA的合成过程,渗透胁迫引起ABA合成后,调控胞内CaM水平。