猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。     

克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞 #br#

 【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosin beta 4,Tβ4) 基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM 2 000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】 克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142 bp,其中包含135 bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(XM002706880.1)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。     

克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞

【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosinbeta4,Tβ4)基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142bp,其中包含135bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(NM_001002885)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。     

传染性造血器官坏死症重组腺病毒载体的构建

【目的】克隆传染性造血器官坏死症病毒(IHNV)G基因,构建其重组腺病毒载体,为IHN预防及疫苗的研制提供参考。【方法】通过RT-PCR和PCR技术扩增IHNV G基因,将G基因插入到腺病毒穿梭载体中,再用带有目的基因的腺病毒载体与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组,构建重组腺病毒质粒,通过PCR扩增及SalⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,经PacⅠ酶切后转染HEK-293细胞进行包装,获得带有目的基因的重组腺病毒,通过观察绿色荧光蛋白表达情况来监控重组腺病毒,用Western-blot法检测糖蛋白的表达,并测定重组腺病毒的TCID_(50)。【结果】成功克隆出IHNVG基因,其长度为1 533bp。成功构建了IHNV G蛋白重组腺病毒载体。GFP监测显示,重组腺病毒转染成功。重组腺病毒能在HEK-293细胞中表达出分子质量约58ku的产物,与预期相符,其TCID_(50)达到1.0×10~(10.4)mL~(-1)。【结论】成功构建了带有IHNVG基因的重组腺病毒载体,重组腺病毒能高效表达,滴度较高。     

鸡α干扰素/白细胞介素18基因的融合表达及抗病毒活性研究

【目的】构建原核表达载体p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18、大肠埃希菌Escherichia coli表达及产物纯化与活性检测,研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂,以对鸡的病毒性疾病进行防治.【方法】采用融合PCR(Fusion PCR)方法,利用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸将鸡α干扰素(Chicken interferon alpha,Ch IFN-α)与鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,Ch IL-18)基因构建Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因并克隆入p ET-28a原核表达载体中进行原核表达.通过镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDSPAGE分析、Western-blot鉴定.采用细胞病变抑制法检测r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)及新城疫病毒(NDV)增殖活性.【结果和结论】成功构建并克隆了p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因.融合基因在大肠埃希菌中表达的r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白相对分子质量约为38 000,蛋白经纯化后纯度在90%以上.r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在鸡胚成纤维(CEF)细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV和NDV的活性明显高于单一r Ch IFN-α、r Ch IL-18蛋白的抗病毒活性.     

华山新麦草α-醇溶蛋白基因的克隆及原核表达分析

 【研究目的】克隆华山新麦草（Psathyrostachys huashanica）的α-醇溶蛋白基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。【方法】采用同源克隆法从华山新麦草基因组DNA中分离克隆出α-醇溶蛋白基因并进行序列分析,将克隆的华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5克隆到表达载体pET-28a (+)上,获得重组质粒pET28a-Gli-Ns转化大肠杆菌BL21 (DE3)并诱导表达。【结果】从华山新麦草基因组DNA中克隆了4个α-醇溶蛋白基因：Gli-Ns-2 (FJ713595)、Gli-Ns-3 (GQ139525)、Gli-Ns-4 (GQ139526)和Gli-Ns-5 (GQ139527)。序列分析表明,4条序列具有α-醇溶蛋白基因的典型结构特征,含有8个或9个半胱氨酸残基,序列FJ713595为假基因。利用所构建的大肠杆菌表达载体,经IPTG诱导,华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5(GQ139527)可在原核系统中特异性表达。Western-blot证实融合蛋白可成功表达。【结论】克隆了4个华山新麦草的α-醇溶蛋白基因序列,基因Gli-Ns-5(GQ139527)可在原核表达系统中成功表达,为小麦品质改良提供了新的候选基因。     

含MDV gB CTL表位与鸡HSP108融和蛋白基因的构建及原核表达

【目的】为新型马立克氏病(MD)疫苗的开发奠定基础。【方法】以SPF鸡肝脏中提取RNA为模板,利用RT-PCR反应扩增鸡HSP108基因;利用PCR方法扩增MDV gB CTL表位基因,并将MDV gB CTL表位基因与鸡HSP108融合在一起,构建融合蛋白基因rgBHSP108,将该融合蛋白基因克隆入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-gBHSP108,将该重组载体转化E.coliBL21(DE3),并用IPTG诱导融合蛋白rgBHSP108的表达,对rgBHSP108进行SDS-PAGE电泳、可溶性分析、蛋白纯化及Western-blot分析。【结果】扩增到鸡2.4kb的HSP108基因和330bp的MDV gB CTL表位基因;克隆的鸡HSP108基因序列与GenBank上发表的鸡输卵管HSP108(NM204289)和来源于肝脏HSP108(AF387865)核苷酸的同源性分别为99.7%和99.0%。rgBHSP108融合蛋白基因构建成功;融合蛋白rgBHSP108以包涵体的形式获得高效表达并纯化。Western-blot分析表明,针对MDV gB CTL表位的多抗可以与融合蛋白发生特异性反应。【结论】成功构建了鸡HSP108融合蛋白基因,利用原核表达系统成功表达rgBHSP108。     

斯氏艾美耳球虫MIC-5与兔IL-15基因在真核细胞中的共表达

 【目的】构建能在真核细胞中共表达斯氏艾美耳球虫微线蛋白5（MIC-5）和兔IL-15重组载体,为进一步研究抗斯氏艾美耳球虫的免疫调节性DNA疫苗奠定基础。【方法】将斯氏艾美耳球虫MIC-5和兔IL-15基因,克隆到真核双表达载体pBudce4.1中,应用脂质体介导法将构建的重组质粒pB-MIC-5-IL-15转染BHK-21细胞。在转染后,用RT-PCR法和间接免疫荧光试验（IFA）分别检测MIC-5和IL-15基因在BHK-21细胞中的转录和表达情况。【结果】在重组质粒pB-MIC-5-IL-15转染BHK-21细胞24 h后即可检测到MIC-5、IL-15基因进行了转录;在转染36、48、72h后,MIC-5和IL-15基因可同时在BHK-21细胞中表达。【结论】成功构建了含有斯氏艾美耳球虫MIC-5和兔IL-15基因的重组载体,实现了两种基因在真核细胞中的共表达,为抗斯氏艾美耳球虫的免疫调节性DNA疫苗研制奠定了基础。     

草兔卵透明带3(ZP3)基因真核表达载体的构建与表达

【目的】利用基因重组技术将草兔卵透明带3基因(ZP3)构建到真核表达载体上,并在RK-13细胞中表达ZP3蛋白,为后期的免疫不育研究提供方便。【方法】提取草兔卵巢总RNA,采用RT-PCR方法克隆ZP3基因,将其与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1-ZP3表达载体,并将载体转入RK-13细胞中进行ZP3表达。利用倒置荧光显微镜、RT-PCR和Western Bolt方法对重组ZP3蛋白表达情况进行观测。【结果】RT-PCR获得长为1 260bp的草兔ZP3基因;成功构建pEGFP-N1-ZP3重组质粒,将其转染RK-13细胞后表达出73ku的重组ZP3蛋白,RT-PCR验证和Western Bolt结果与ZP3基因的理论长度一致。【结论】首次构建了草兔ZP3基因真核表达载体并成功在真核细胞中表达重组ZP3蛋白。     

内蒙古白绒山羊VEGF164基因毛囊特异性表达载体的构建及胎儿成纤维细胞的稳定转染

 【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164（vascular endothelial growth factor 164,VEGF164）基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV（6.3 kb）。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】在构建的表达载体pCDsRed2-KV中,VEGF164基因被正确连接在毛囊特异性启动子KAP6-1下游,基因下游按顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因;外源KAP6-1启动子和VEGF164基因整合到细胞基因组中。【结论】成功构建稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164的真核表达载体,稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过克隆技术获得转VEGF164基因绒山羊提供了条件。