利用高效农杆菌遗传转化系统将ACP反义基因片段导入油菜

通过对已有的油菜农杆菌遗传转化体系的改进，建立了一种利用农杆菌感染油菜子叶柄的高效遗传转化方法，经过农杆菌感染的子叶柄在含有6-BA2．0mg／L，IBA0．15mg／L，AgNO33．5mg／L的MS培养基上由卡那霉素抗性愈伤组织分化出抗性幼苗的频率达到12．28％。利用已经构建的含有油菜Napin启动子加上反义ACP脱饱和酶第一外显子、内含子的基因片段的植物双元表达载体pNACP，将该反义ACP基因片段转入油菜“沪油15”；PCR和GUS染色结果表明抗性植株中有60％的植株含有导入的目的基因。这为油菜籽脂肪酸遗传改良提供了一种新的方法。     

利用农杆菌介导法获得转基因香蕉植株

用含质粒pBI426的根癌农杆菌EHA105转化香蕉品种威廉斯的横切薄片,在含100mg/L卡那霉素和600mg/L羧苄青霉素的MS分化培养基上诱导分化芽,获得17株转化苗。抽提植株DNA,以未转化植株为阴性对照,进行聚合酶链式反应,结果发现7株苗含有GUS基因。这初步证明了GUS基因已经转入香蕉薄片中。     

农杆菌介导的紫穗槐茎段愈伤组织遗传转化研究

采用农杆菌介导法对紫穗槐茎段诱导的愈伤组织进行遗传转化研究。确定了卡那霉素临界耐受浓度为40mg/L。菌液浓度与侵染时间的正交试验结果表明:侵染菌液OD600为0.8、侵染时间为30min时转化效率最高,达17.95%。GUS染色检测分析表明:含pBI121-GUS质粒DNA农杆菌侵染转化的愈伤组织其抗性不定芽和再生植株根和叶均呈蓝色。转化植株叶PCR检测结果表明外源GUS基因已整合到紫穗槐基因组中。以上结果表明建立了以茎段诱导愈伤组织为转化受体、农杆菌介导的紫穗槐高效遗传转化体系。为了验证其可重复性,又进行了pBI121-GFP基因的转化,T0代再生植株PCR检测整合率达85%,在488nm蓝光源激发下转化株的顶芽产生绿色荧光,说明转入的基因在35S启动子下过量表达。此遗传转化体系可应用于转基因育种。     

农杆菌介导法将LFY基因导入苹果的研究

以M26苹果叶片为外植体,利用GUS瞬时表达率,对农杆菌介导法转化苹果的因素进行优化,通过含LFY基因的根癌农杆菌EHA105转化苹果叶片,获得了提早开花的转基因植株。结果表明:以OD600=0.3~0.5农杆菌菌液侵染叶片,25℃条件下共培养,共培养后的叶片延迟筛选3 d,在附加卡那霉素30 mg/L的再生培养基中选择培养,转化芽再生率可达6.97%。PCR检测初步证明目的LFY基因已整合到苹果基因组中。     

本生烟草组培再生及遗传转化的研究

[目的]获得本生烟草转胰高血糖素样肽-1基因植株。[方法]以本生烟草无菌苗叶片为外植体材料,建立本生烟草再生系统,通过农杆菌叶盘法浸染进行遗传转化,获得本生烟草转胰高血糖素样肽-1基因植株。[结果]通过多重比对和重复,确定本生烟草叶片最适分化培养基为MS＋1.5mg/L6-BA＋0.1mg/LNAA,生根培养基为MS＋0.1mg/LIBA;经由卡那霉素浓度梯度试验,确定选择压力为5mg/L卡那霉素;对经卡那霉素筛选获得的抗性芽进行GUS组织化学检测,获得阳性信号。[结论]初步证实外源基因胰高血糖素样肽-1已整合到本生烟草基因组中。     

农杆菌介导的矮牵牛遗传转化美洲商陆抗病毒蛋白基因的研究

为获取矮牵牛抗病毒株系,利用农杆菌介导的叶盘法,对3个品种的矮牵牛进行了PAP(美洲商陆抗病毒蛋白)基因遗传转化试验。结果表明,矮牵牛基因型对抗性芽的再生有显著影响,只有红色波浪系矮牵牛在含100 mg/L的卡那霉素筛选培养基上获得抗性芽,进一步转入含卡那霉素100 mg/L的生根培养基上进行筛选,获得31个株系的生根植株。对再生植株进行PCR检测,初步证明PAP基因已整合到其中29个株系的矮牵牛基因组中。     

白桦抗虫基因转化的初步研究

用根癌农杆菌介导法对白桦（Betula platyphylla)进行转化，获得了转化再生植株。卡那霉素抗性愈伤组织产生率达10%-22%，抗性不定枝的生根率达80%以上。经分子生物学检测，在卡那霉素抗性转化植株中，有34%检测出GUS活性，76.5%的卡那霉素抗性植株的Southern斑点杂交呈阳性反应。初步证明，抗虫基因已转入白桦中。     

根癌农杆菌介导 hGLP1基因转化摩尔多瓦葡萄的研究

以摩尔多瓦葡萄早期体细胞胚为受体,通过农杆菌介导辅以超声波处理转化 hGLP1基因。结果表明,摩尔多瓦葡萄体细胞胚的卡那霉素临界致死质量浓度为10 mg/L,农杆菌浸染时辅以超声波处理可显著提高GUS瞬时表达效率（高达69.4%）。采用此体系对摩尔多瓦葡萄进行转化,获得高瞬时表达和稳定表达的转化子,进一步筛选培养获得7株抗性再生植株。利用PCR扩增的方法进行检测,其中2株PCR检测呈阳性,初步证实 hGLP1基因已整合到摩尔多瓦葡萄基因组。     

天山雪莲遗传转化体系建立

采用根癌农杆菌介导法进行GFP基因的遗传转化,建立了农杆菌介导天山雪莲遗传转化体系。以天山雪莲胚性愈伤组织为受体;40 mg/L的卡那霉素为胚性愈伤组织筛选质量浓度;胚性愈伤组织预培养2 d后用含100μmol/L AS和500 mg/L脯氨酸的感染工程菌液侵染25 min,能够取得比较理想的转化效果。对8株卡那霉素抗性植株进行PCR及GFP荧光蛋白检测,共获得6株阳性植株。结果表明GFP基因已整合到天山雪莲的基因组中并得到表达。     

根癌农杆菌介导Barnase基因转化‘美人指’葡萄的研究

以'美人指'葡萄离体叶片及叶柄为农杆菌介导转化Barnase基因的受体,对农杆菌侵染时间、共培养时间、预培养时间、卡那霉素选择压以及头孢霉素浓度等因素进行了研究.结果表明:最佳的农杆菌介导'美人指'葡萄遗传转化体系为农杆菌侵染4 min,共培养3 d,预培养3 d,卡那霉素选择压3.0 mg·L-1,头孢霉素质量浓度250 mg·L-1.采用此体系对'美人指'葡萄进行转化,共获得了12株抗性苗,农杆菌感染后的不定芽再生率为1.78%.利用GUS组织化学染色、PCR扩增的方法进行检测,结果表明,其中只有2株GUS染色呈阳性,阳性率为16.67%;有3株通过了PCR检测,初步证实Barnase基因已经整合进入'美人指'葡萄基冈组中.     

薹菜再生体系的建立

为了建立薹菜再生体系进而为转基因工作做准备,以薹菜无菌苗子叶-子叶柄和下胚轴为外植体,研究了适于薹菜再生的外植体类型,以苗龄、AgNO3 的质量浓度和植物生长调节剂组合,建立了薹菜的再生体系.结果表明,5 d苗龄的子叶-子叶柄为最佳外植体材料. 筛选出最佳培养基为1/2NH4+浓度的MS+BAP 5 mg/L+ZT 2 mg/L +NAA 0.7 mg/L+AgNO3 7.5 mg/L,子叶-子叶柄再生频率达67.8%.     

优化白菜类蔬菜遗传转化体系的研究

采用农杆菌介导法将双元载体质粒pBI35S-AMF分别导入"上海青"白菜和"油青"菜心,对影响转化频率的抑菌剂和感染菌株等主要因素进行比较,优化了白菜类蔬菜的遗传转化体系.结果表明,在白菜类蔬菜的遗传转化体系中,选择氨苄青霉素作为转化农杆菌的抑菌剂为好,其抑菌浓度以300 mg/L为宜;预培养时间和共培养时间分别以3 d和2 d为适;LBA4404/pBI35S-AMF菌株的感染效率远高于EHA105/pBI35S-AMF.对KanR转化植株做进一步的分子检测结果显示,Southern印迹杂交阳性率为82.2%,转化频率达2.8%,且外源片段为多拷贝插入.多批次的转化结果证实,该体系的转化频率稳定.     

影响农杆菌介导朝仓花椒遗传转化因素研究

为建立农杆菌介导的朝仓花椒遗传转化体系,以朝仓花椒叶柄及茎段为转化受体,研究了预培养时间、侵染菌液浓度、侵染时间、共培养时间等因素对转化效率的影响。获得转化体系如下：外植体预培养3d,在OD600为0.5～0.8菌液侵染10min,共培养3d,延迟7d筛选,以30和50mg/L卡那霉素（Kan）进行梯度筛选。结果表明：...     

菜薹花药培养出胚率的影响因素研究

以红菜薹、白菜薹、菜心24个品种为试验材料,采用不同的培养基及培养方式,研究基因型、培养基成分及培养方式对不同品种菜薹花药培养诱导率的影响。结果表明:有15个品种的花药诱导出胚,各品种间的出胚率差异显著;红菜薹、白菜薹、菜心中出胚率最高的分别为H08-4(1.38胚/蕾)、B08-7(,0.757胚/蕾)、C08-4(0.682胚/蕾);采用Keller培养基+10%蔗糖+0.1%活性炭作为花药胚状体诱导培养基;花药培养出胚率以接种在双层培养基中的效果最佳。     

甘蓝型黑籽油菜遗传转化中预培养环节的优化

[目的]对甘蓝型黑籽油菜遗传转化中预培养环节进行优化。[方法]利用甘蓝型黑籽油菜下胚轴为外植体,对油菜下胚轴的预培养及其浸染后影响再生和分化情况进行研究,分别从苗龄、激素两方面讨论了下胚轴再生与分化频率的影响。[结果]苗龄、激素与遗传转化之间存在密切的联系。在农杆菌介导的油菜下胚轴预培养最佳体系是:4 d苗龄的外植体在农杆菌侵染前进行5 d预培养,预培养基是MS+2,4-D 1.0 mg/L+6-BA 4.0 mg/L。绿色抗性愈伤组织获得GUS瞬时表达,PCR鉴定再生植株为转基因植株。[结论]该研究获得了最佳的预培养条件,为建立一个高效的遗传转化体系奠定基础。     

薹菜种质资源的RAPD和ISSR分析

【目的】对29份薹菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis Makino var.tai-tsai Hort) 种质资源进行遗传多样性和亲缘关系分析,为薹菜的种质资源保护和利用奠定基础。【方法】利用优化的RAPD和ISSR标记体系,对采自山东、江苏和北京的29份薹菜品种进行DNA多态性分析,并采用类平均法对29份薹菜品种的RAPD和ISSR扩增结果进行聚类分析。【结果】从273条RAPD引物中筛选的33个RAPD引物,共扩增出了336条清晰的谱带,其中293条显示多态性,平均每个引物扩增出10.2条多态性谱带,多态性比率为87.2%。利用RAPD标记构建了29份薹菜资源的聚类树状图,距离系数为0.63～0.79。从100条ISSR引物中筛选的45个ISSR引物,共扩增出了522条清晰的谱带,其中414条显示多态性,平均每个引物扩增出9.2条多态性谱带,多态性比率为79.3%;利用ISSR标记构建了29份薹菜资源的聚类树状图,距离系数为0.70～0.86。【结论】基于RAPD和ISSR标记构建的29份薹菜品种的聚类树状图虽有一定差异,但总体趋势一致,1、20、21号薹菜与其他品种的遗传距离相对较远。     

分葱对黄瓜、萝卜和白菜的化感作用

以黄瓜(Cucumis sativusL.),萝卜(Raphanus sativusL.)和白菜(Brassica chinensisL.)3种蔬菜作物为受体,通过种子萌发试验及幼苗生长试验,对分葱(Allium fistulosumL.var.caespitosum Makino)根系及其地上部水浸液的化感作用进行了初步研究。结果表明:分葱根系和地上部水浸液对黄瓜、萝卜和白菜具有一定的化感作用。对黄瓜和萝卜的萌发有一定的抑制作用,而对其幼苗生长有一定的促进作用;对白菜的萌发表现为低浓度促进高浓度抑制,而对其幼苗生长有一定的抑制作用。因此,在蔬菜栽培制度中,分葱可与黄瓜和萝卜进行合理的轮作与间套作;但可能不适宜与白菜进行轮作或间套作。     

不同春化时间对不结球白菜现蕾开花的影响

为探求不同品种不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)的冬性强弱,找出其适宜的春化时间,以4个不结球白菜品种为试材,在3℃条件下分别对萌动种子春化处理10、15、20、25 d,调查不同春化时间对各品种现蕾开花的影响,综合评价植株现蕾开花早晚及开花期植株形态。结果表明,奶白菜最适春化时间为10 d,青梗白菜最适春化时间为15 d,乌塌菜最适春化时间为20 d,京水菜最适春化时间为25 d。4个不结球白菜品种冬性由弱到强为奶白菜、青梗白菜、乌塌菜、京水菜。     

广东省清远市郊菜心最佳营养配方研究

[目的]研究广东省清远市郊菜心（Brassica campestricL.ssp.chinensisvar.utilisTsenet Lee）的最佳营养配方。[方法]利用经典的＂3414＂试验设计方案,对清远市郊的菜心种植地进行测土配方试验。[结果]氮、磷、钾施用量与菜心产量呈现二次函数关系,相关系数均在0.9300以上。根据斯坦福方程分析,土壤的供肥系数与肥料的利用率均受施肥量的影响,并呈现一定的规律性。通过回归方程得出,清远市郊菜心的最佳营养配方为：N90.00kg/hm^2,P2O597.50kg/hm^2和K2O375.00kg/hm^2。[结论]该研究完善了菜心科学施肥指标体系,可为大面积生产无公害菜心提供理论依据。     

Studies on Genetic Transformatiom of Embryogenic Suspension Cultures of Sweetpotato

Genetic transformation of embryogenic suspension cultures of sweetpotato cv. Lizixiang wasconducted by using Agrobacterium tumefaciens strain A208SE harboring the binary vectors pROA93 with β-glucronidase (GUS) and neomycin phosphotransferase (NPT Ⅱ ) genes. The results indicated that embryogenicsuspension cultures precultured for 1 -3 d were suitable for the transformation. The optimal cocultivation timewas 4 - 5 d. The optimal concentration of kanamycin was 50-75 mg L-1 for suspension culture and 100 mg L-1for embryogenic callus proliferation and plant regeneration. The optimal concentration of carbencillin was 100mg L-1. Transgenic plants identified with GUS assays and PCR analyses were obtained.