养殖龟鳖源气单胞菌耐药性与质粒介导喹诺酮类耐药基因分析

为了解养殖龟鳖源气单胞菌的耐药情况及质粒介导的喹诺酮类耐药(PMQR)、喹诺酮类耐药决定区(QRDR)与耐药表型之间的关系;实验采用K-B纸片法测定了1996—2013年从广东地区患病龟鳖分离的67株气单胞菌对23种常见抗菌药物的耐药性,并检测5种PMQR基因qnrA、qnrB、qnrS、qepA和aac(6')-Ib-cr,同时分析PMQR基因阳性菌株染色体上gyrA、parC基因QRDR的突变情况。结果显示,67株气单胞菌对氨苄西林、头孢噻吩和磺胺复合物的耐药率分别高达100%、92.54%和83.58%,对喹诺酮类药物呈现中等耐药,耐药率介于19.40%~64.18%,而对亚胺培南、呋喃妥因、阿米卡星、头孢噻肟敏感性较高,耐药率低于10%;79.10%(53/67)的菌株对3类或以上抗菌药物具有耐药性。19.40%(13/67)的菌株携带PMQR基因,其中,8.96%(6/67)携带qnrS1基因、5.97%(4/67)携带qnrS2基因、7.46%(5/67)携带aac(6')-Ib-cr基因[其中2株同时携带qnrS2和aac(6')-Ib-cr基因]。13株PMQR基因阳性菌株均分别携带1~4个质粒,大小介于0.8~15 kb;其中6株在gyrA基因及parC基因上均发生变异,3株仅在gyrA基因上发生变异,另外4株未发现QRDR的基因突变。研究表明,广东地区龟鳖源气单胞菌对多种抗菌药物耐药并存在多重耐药现象;而且PMQR机制的存在预示着喹诺酮类耐药性很可能会在水产临床上更加快速而广泛地传播,应引起重视。     

鳜致病性类志贺邻单胞菌的分离鉴定及耐药性分析

2019年江苏扬州某养殖场鳜出现大量死亡，临床症状表现为体表溃疡、鳃丝腐烂等，解剖发现肝脏出血。为查明鳜死亡病因，自濒死鳜分离到优势生长细菌，通过形态观察、理化特性测定及16S rRNA基因同源性分析进行分离菌的种属鉴定，同时通过人工感染试验、毒力基因检测确定其致病性，并通过纸片扩散法进行耐药性分析。结果表明：引起鳜大量死亡的病原菌株SN1为类志贺邻单胞菌，其对鳜的半数致死密度为1.05×10⁵ cfu/mL;类志贺邻单胞菌SN1携带astA、astB、astD、astE、actP、aphA等6个毒力相关基因；类志贺邻单胞菌SN1对青霉素G和克林霉素2种药物耐药，对哌拉西林、苯唑西林和麦迪霉素等6种药物中介，对恩诺沙星、硫酸新霉素、盐酸多西环素、氟苯尼考等26种药物敏感。本试验结果可为类志贺邻单胞菌引起鳜细菌性疾病的防治提供理论依据。     

副溶血弧菌养殖对虾分离株耐药性及耐药基因分析

文章采用琼脂稀释法检测从养殖患病对虾中分离的36株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)对16种药物的耐药性,并用PCR法检测喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS和qnrVC,酰胺醇类耐药基因cat、optrA、floR和cfr,四环霉素类耐药基因tetA、tetB和tetM,磺胺类耐药基因sul1、sul2和sul3,氨基糖苷类耐药基因strA、strB、aadA和aacA,利福霉素类耐药基因arr,β-内酰胺类耐药基因bla CARB和大环内酯类耐药基因erm的携带状况,分析其耐药表型和基因型之间的相关性。结果显示,36株副溶血弧菌对β-内酰胺类药物氨苄西林耐药率最高(88.9%),其次为磺胺类药物磺胺甲噁唑(66.7%),硫酸新霉素、庆大霉素、头孢曲松和美罗培南呈现100%敏感。多重耐药副溶血弧菌比例高达61.1%(22/36),其中1株对6类抗菌药耐药。喹诺酮类耐药基因qnrVC检出率最高达72.2%(26/36);其次为氨基糖苷类耐药基因srtB,检出率58.3%(21/36);大环内酯类、利福霉素类耐药基因均未检测到。耐药基因检出率与耐药表型没有表现出一一对应的关系,提示副溶血弧菌耐药的复杂性。     

乌鳢源气单胞菌的耐药表型与耐药基因研究

对18株分离自患病乌鳢的气单胞菌进行了6大类共11种常用抗菌药物的耐药性研究。药敏试验结果显示,这18株菌对磺胺类药物--甲氧嘧啶、复方新诺明产生了高达100%的耐药性,对红霉素、阿米卡星、四环素也有一定的耐药率(50%~90%),而对喹诺酮类3种药物--恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星则耐药率较低,并存在多重耐药的现象。通过对喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类、氯霉素类等4大类抗生素15种耐药基因进行检测,发现ant、qnr S、cat检出率较高,分别为50.0%、44.4%、38.9%,而qnr B、cat B基因则未检出。同种细菌不同分离株表现出不同的耐药性,结果表明,生产用药时有必要针对病原进行药敏试验,筛选敏感药物进行疾病防治。     

猪-鱼复合养殖模式中气单胞菌I类整合子的流行情况及其耐药特征

为了解广东地区猪-鱼复合养殖模式下气单胞菌整合子流行情况及其耐药特征,从广东省5个不同猪-鱼复合养殖场采集分离猪粪、鱼、池塘水及池塘底泥的气单胞菌共317株,通过微量二倍稀释法测定其对20种药物的敏感性;PCR扩增Ⅰ类整合子整合酶基因intI1,并分析其基因盒阵列结构。结果表明,317株气单胞菌对20种药物耐药程度不一,氨苄西林、磺胺间甲氧嘧啶、萘啶酸的耐药率相对较高。intI1的检出率为15.77%,鱼源和猪源的整合子检出率高于环境源。整合子阳性菌对测试的12种药物的耐药率显著高于阴性菌,且表现为多重耐药;50个Ⅰ类整合子共检测到16种耐药基因盒,包括了编码氨基糖苷类耐药基因aadA1、aadA2、aac6-Ⅱ、aacA4,甲氧苄啶耐药基因drfA1、dfrA12、dfrA15、dfrA17、dfrB4,β内酰胺类耐药基因bla_(OXA-10)、bla_(OXA-21),氯霉素耐药基因catB3、catB8,利福平耐药基因arr2、arr3以及质粒介导的喹诺酮类耐药基因aac(6')-Ib-cr。携带了不同类耐药基因盒的整合子阳性菌还表现出所对应的对甲氧苄啶、链霉素、氯霉素类等的耐药表型,由此推测整合子的存在与细菌的多重耐药密切相关。研究表明,I类整合子分布于广东地区猪-鱼复合养殖模式下不同来源气单胞菌,并介导细菌对多种抗菌药物耐药。有必要开展畜禽-鱼复合养殖模式下细菌耐药性的传播机制研究,为水产养殖合理用药提供依据。     

迟钝爱德华氏菌耐药表型及4种耐药基因检测

从7起牙鲆迟钝爱德华氏菌感染病例中分离到130株致病菌,每个病例挑选5株共计35株,用K-B纸片扩散法检测其耐药表型;用PCR方法检测!-内酰胺类TEM基因、氨基糖苷类ant(3")-Ⅰ基因、磺胺类Sul3基因和四环素类tet(A)基因,分析耐药基因与耐药表型间的关系,以查明牙鲆源致病性迟钝爱德华氏菌不同类型常见耐药基因的携带状况,探讨耐药基因与耐药表型之间的相关性。结果显示,所检的35株迟钝爱德华氏菌均携带TEM基因和ant(3")-Ⅰ基因,62.9%(22/35)携带Sul3基因,未检出tet(A)基因;所有菌株均具有多重耐药性,大部分菌株耐抗菌类药物达7~9种;耐药基因的携带与耐药表型间存在较密切的相关性,但并非完全对应。     

禽源致病性沙门氏菌四环素耐药性基因tetC的PCR扩增及序列分析

通过对临床分离并经生化试验和血清学试验鉴定的20株禽源沙门氏菌和1株标准株C79-13进行药敏试验,结果证明:有19株有高耐药性,另外2株有低耐药性,耐药率达100%;对其四环素耐药基因tetC进行了PCR扩增,结果获得以质粒为模板的特异性产物,与药敏试验符合率为100%;利用PCR检测四环素耐药基因tetC具有很高的敏感性和特异性,从而为禽类致病性沙门氏菌的耐药性检测提供了高效敏感的手段.     

海南无乳链球菌的毒力基因与耐药特性分析

无乳链球菌可感染人与其他动物,是一种重要的致病菌。为探明海南地区无乳链球菌的毒力基因携带率及耐药情况,以2017年间实验室所采集鉴定的18株无乳链球菌(人源4株,鱼源14株)为样本,利用PCR技术和抗菌药物药敏纸片进行毒力基因、耐药基因的扩增和药物敏感性的检测,结果发现,常见毒力基因阳性检出率较高,其中有11种毒力基因均100%携带,另外3种基因阳性率也超过66.7%;耐药基因扩增结果显示,除四环素类和氨基糖苷类耐药基因均呈阴性以外,其余耐药基因阳性检出率较高(44.4%~100%);而药敏检测显示,无乳链球菌对β-内酰胺类、大环内酯类、林可胺类抗生素耐药性高,而对于氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类抗生素敏感性高。总体上,药敏情况和耐药基因的检测结果一致。研究结果发现,分离得到的不同来源的无乳链球菌中毒力基因检出频率高,耐药性强,需要引起高度重视,试验结果将为无乳链球菌的防治提供重要的参考。     

罗非鱼水产品中的喹诺酮类药物耐药菌和耐药基因检测分析

本研究旨在了解水产品中携带的细菌对喹诺酮类药物的耐药状况及耐药基因类型,评估水产品中细菌耐药性风险。从广州市14家超市随机购买100条鲜活的罗非鱼,高通量测序分析结果显示,罗非鱼携带的优势菌群为大肠埃希菌(Escherichia hydrophila)和气单胞菌(Aeromonas)。采用大肠埃希菌和气单胞菌筛选培养方法,分别从鳃、肌肉和肠内容物筛选分离出182株大肠埃希菌和280株气单胞菌;运用琼脂二倍稀释法测定了恩诺沙星和环丙沙星对分离菌株的最小抑菌浓度;通过PCR法扩增质粒介导的喹诺酮类耐药(PMQR)基因(qnrA、qnr B、qnrC、qnrD、qnrS、aac(6￠)-Ib-cr、qepA、oqxAB)并进行测序和比对分析。结果显示,分离的气单胞菌对恩诺沙星和环丙沙星的耐药率分别为2.50%和2.14%;分离的大肠埃希菌对恩诺沙星和环丙沙星的耐药率分别为25.82%和18.13%。肌肉中分离的气单胞菌和大肠埃希菌对恩诺沙星和/或环丙沙星的耐药率均低于鳃和肠道的;各组织分离的大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物的耐药率均远高于气单胞菌。分离菌株中,携带PMQR基因的大肠埃希菌占59.89%,且检出的耐药基因种类较多,包括qnrB、qnrD、qnrS、aac(6?)-Ib-cr和oqx AB;而携带PMQR基因的气单胞菌仅占6.79%,只检出耐药基因aac(6￠)-Ib-cr和qnrS。结论认为,罗非鱼食用部分肌肉携带的耐药菌较少,食品相对安全;肠道和鳃组织携带的耐药菌以大肠埃希菌为主,而且大部分菌株携带有不同类型的PMQR基因,存在一定的耐药传播隐患。     

秦皇岛地区克氏原螯虾源嗜水气单胞菌分离及生物学特征分析

为鉴定引起克氏原螯虾死亡的病原菌及分析其生物学特征,从秦皇岛地区病死的疑似细菌感染的克氏原螯虾的肝脏和胰腺分离出1株病原菌,暂定名为ProcQHD。经细菌分离鉴定和16S rRNA基因序列分析,该菌株被鉴定为嗜水气单胞菌。通过人工感染动物试验、PCR法及K-B药敏纸片对其致病性、毒力基因、耐药基因及耐药性进行了研究。结果表明,ProcQHD株的LD₅₀为1.0×10⁵ CFU/mL,携带ser、act、exu、lip和Luxs 5种毒力基因;ProcQHD株对替米考星、头孢曲松、环丙沙星、土霉素、诺氟沙星等12种药物高度敏感且携带Tet(A)、Tet(C)、Tet(E)、qepA、gyrB、aac4、aadB、Ant-Ia、Sul-1、LAP-1、SHV 11种耐药基因。分析发现ProcQHD株的某些耐药表型与耐药基因之间有一定相关性。     

大菱鲆弧菌耐药谱、耐药基因检测和ERIC-PCR分型分析

2020年6—10月,从辽宁地区患病大菱鲆(Scophthalmus maximus)体内共分离到394株菌株.基于16S rRNA序列鉴定分离株,采用微量稀释法分析随机挑选的18株大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)对8种抗生素的敏感性,检测其耐药基因携带情况,并基于ERIC-PCR进行分型研究.结果显...     

患病草鱼肠道病原菌的分离鉴定及毒力研究

自环洞庭湖区精养鱼池患病草鱼肠道中分离获得4种病原菌,进行16S rRNA基因和gyrB基因序列测定和在线比对,并对草鱼进行回归感染。随后进行4种病原菌的药敏特征、溶血活性试验,并利用PCR方法检测了6种毒力因子的携带情况。试验结果表明,病原菌分别为温和气单胞菌、异常嗜糖气单胞菌、类志贺邻单胞菌和格氏乳球菌;4种病原菌回归感染草鱼,均能使草鱼患病致死,自死亡的草鱼体内均能分离得到相应感染的病原菌;4种病原菌对多种抗生素具有耐药性,且在脱纤维绵羊血血平板上检测到了温和气单胞菌、异常嗜糖气单胞菌AaB007的溶血活性;PCR结果表明,4种病原菌携带多种毒力因子。研究结果可为环洞庭湖区草鱼精养鱼池健康养殖及病害防治提供科学依据。     

Identification and detection of Pseudomonas plecoglossicida isolates with PCR primers targeting the gyrB region

Pseudomonas plecoglossicida is the agent of bacterial haemorrhagic ascites (BHA) in freshwater fish farming in Japan. To develop a rapid identification and detection method for P. plecoglossicida, a PCR amplification technique targeting the chromosomal DNA region coding the B subunit of the DNA gyrase (gyrB) was used. The nucleotide sequences of gyrB were determined in nine isolates of P. plecoglossicida and two other Pseudomonas species. On the basis of these determined sequences and the gyrB sequences of other Pseudomonas species or fish pathogenic bacteria deposited in international nucleotide sequence databases (GenBank/EMBL/DDBJ), PCR primers PL-G1F, PL-G1R, PL-G2F and PL-G2R were designed for specific amplification of the partial gyrB of P. plecoglossicida. The specificity of these primers in amplifying the gyrB of P. plecoglossicida was verified using selected strains of related bacterial species. The nested PCR technique was used to detect P. plecoglossicida from kidney and intestine of ayu. Primer pair PL-G1F and PL-G1R was used for the external PCR, and primer pair PL-G2F and PL-G2R for the internal PCR. Of 10 ayu juveniles, expected size PCR products were observed from intestine and kidney samples in one and two specimens, respectively. The PCR technique with primers based on the gyrB sequence is thus useful for the diagnosis of BHA.     

广东地区吉富罗非鱼无乳链球菌病的流行情况与耐药性

为了调查广东省惠州、肇庆、珠海、湛江4个吉富罗非鱼主养区链球菌病的流行情况和耐药性,并进一步分析β-内酰胺酶基因与青霉素类药物的耐药性关系。本实验通过传统的方法对菌株进行分离纯化,扩增特异性基因cfb以及16s r DNA对各菌株进行鉴定;采用k-b法测定分离菌株的药物敏感性;通过PCR检测β-内酰胺酶类基因在分离菌株中的分布情况,并用Statistic6.0统计分析各β-内酰胺酶基因与青霉素类药物的耐药关系。实验结果表明,吉富罗非鱼无乳链球菌的阳性率从高到低的顺序为惠州(46.46%)湛江(43.24%)肇庆(17.30%)珠海(4.17%);药敏结果显示各地区无乳链球菌分离株对青霉素(耐药率为94.29%)和磺胺二甲基嘧啶(耐药率为86.40%)普遍耐药,对恩诺沙星最为敏感(耐药率为3.99%);β-内酰胺酶基因分布与细菌耐药性统计结果显示,无乳链球菌基因组中的9个β-内酰胺酶基因在各分离菌株中的分布呈高度多态性,其中SAG0658基因与氨苄青霉素抗性显著相关,提示SAG0658基因在无乳链球菌耐氨苄青霉素过程中发挥主要作用;此外,9个β-内酰胺酶基因与青霉素抗性无相关性,说明其在菌株对青霉素耐药过程中并未发挥明显作用,提示分离菌株对青霉素的耐药性可能依赖其他途径。     

Drug resistance mechanism of the fish-pathogenic bacterium Lactococcus garvieae

The minimum inhibitory concentrations (MICs) of 15 chemotherapeutic agents were tested against 146 Lactococcus garvieae strains isolated from 1999 to 2006 in Japan. The agents used included chloramphenicol, ciprofloxacin, erythromycin (EM), enoxacin, fleroxacin, florfenicol, kanamycin, lincomycin (LCM), norfloxacin, oxolinic acid, orbifloxacin, ofloxacin, benzylpenicillin, streptomycin and tetracycline (TC). Of the tested strains, 46 showed high levels of resistance to EM, LCM and TC. Twelve of these strains were detected to be carrying transferable R-plasmids using a conjugation experiment and, using Southern hybridization, were shown to have the same structure as the R-plasmid. The remaining 34 resistant strains had a similar DNA structure to that of the R-plasmid as confirmed by polymerase chain reaction (PCR) using primers designed from sites in the transferable R-plasmid. The EM and TC resistance genes were classified into the ermB and tetS groups using PCR. We also detected gyrA and/or parC mutants that are highly resistant to old and new generation quinolones. This study revealed that transferable R-plasmids encoding EM, LCM and TC are widely distributed and are conserved regardless of the area and/or time of collection.     

耐喹诺酮类药物嗜水气单胞菌的分离鉴定及电镜观察

本研究对吉林省内12个水域采集和送检的66尾病鱼进行细菌分离鉴定,共检出46株嗜水气单胞菌疑似株,通过生化试验和PCR扩增气溶素基因aer鉴定法,确定其中22株为嗜水气单胞菌。进一步采用纸片扩散法和双倍稀释法测定嗜水气单胞菌分离株对多种抗生素的耐药性,其中部分菌株存在不同程度的耐药性,22株嗜水气单胞菌中有4株对喹诺酮类药物耐药,并且为交叉耐药。其对喹诺酮类药物的抑菌圈均小于19mm。嗜水气单胞菌耐喹诺酮类药物的检出率为18 2%。将病料中分离的8株嗜水气单胞菌在电镜下观察发现,2株耐药菌表面发现均匀分布的球形结构,而6株敏感菌表面未见此结构。     

海水养殖动物源弧菌喹诺酮类药物耐药表型与基因型分析

采用琼脂稀释法测定121株海水养殖源弧菌对喹诺酮类药物(恩诺沙星、诺氟沙星和环丙沙星)的敏感性,利用PCR方法检测其质粒介导的喹诺酮类耐药基因(qnrVC、qnrS、qnrA和qnrB)、外排泵耐药基因(oqxA、oqxB、acrR、marR和soxR)和整合子(Int1、SXT和ISCR1),同时研究4种外排泵抑制剂(甲基吡咯烷酮,NMP;利血平,RSP;羰基氰氯苯腙,CCCP;苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺,PAβN)对弧菌恩诺沙星、诺氟沙星和环丙沙星最小抑菌浓度的影响。在121株弧菌中,恩诺沙星耐药菌株31株(25.6%),诺氟沙星耐药株21株(17.4%),环丙沙星耐药株22株(18.2%);4种质粒介导喹诺酮类耐药基因仅检测到qnrA(2株)和qnrVC(30株),5种喹诺酮类外排泵基因仅在溶藻弧菌352菌株中检测到oqxB;121株弧菌中检测到39株菌携带Int1、42株菌携带SXT、44株菌携带ISCR1;在NMP、RSP、CCCP和PAβN作用下,分别有22株、25株、31株和7株弧菌对恩诺沙星的敏感性下降,分别有6株、5株、9株和4株弧菌对诺氟沙星的敏感性下降,分别有17株、13株、5株和14株弧菌对环丙沙星的敏感性下降。研究结果表明,弧菌对喹诺酮类药物耐药表型与基因型存在较大的不一致性,外排泵抑制剂对弧菌喹诺酮类药物的耐药性具有显著影响,预示弧菌对喹诺酮类药物耐药存在着新的机制。     

对虾养殖池副溶血弧菌的分离鉴定及其耐药特征、毒力基因分析

为了解对虾养殖池中副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的耐药性和毒力基因的携带情况,2018年从山东4个地区的对虾养殖池收集分离副溶血弧菌,采用Kirby-Bauer纸片法检测其对12种抗生素的耐药性,用PCR方法检测其携带耐热直接溶血素基因(tdh)和耐热相关溶血素基因(trh)的情况。从对虾养殖池共分离副溶血弧菌50株。药敏实验结果显示,副溶血弧菌对庆大霉素、硫酸新霉素和氨苄西林的耐药情况最为严重,耐药率分别高达98%、90%和86%,对氟苯尼考、氯霉素、头孢他啶等敏感性较高,耐药率分别为10%、10%和20%。88%的菌株具有多重耐药性。毒力基因检测结果显示,所有菌株均不携带tdh基因,4%的菌株表现为trh阳性。本研究表明,对虾养殖水环境中的副溶血弧菌对抗生素的耐药性较为严重,应加强副溶血弧菌的病原学监测,在养殖过程中合理使用抗生素,以实现水产养殖业健康发展。