绵羊基因组中内源性绵羊肺腺瘤病毒相关序列的确定

绵羊都含有与绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)密切相关的15~20拷贝内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)相关序列。宿主可利用内源性病毒来预防致病性反转录病毒的感染,一些内源性病毒可以有效地干扰相关外源性病毒的复制。本试验通过分子生物学手段确定了蒙古绵羊基因组中含有enJSRV6和enJSRV10两个内源性病毒基因而内蒙古白绒山羊中未发现。通过比较内、外源病毒LTR序列的酶切图谱,获得专一作用外源性病毒的核酸内切酶M spⅠ、TfiⅠ、BsaWⅠ,如果将酶切与聚合酶链式反应(PCR)相结合,不需要经过测序就可分辨enJS-RV和外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV),形成"酶切-PCR"检测技术,将为绵羊肺腺瘤病的快速诊断提供了新的手段。     

绵羊肺腺瘤病毒检测方法的研究进展

绵羊肺腺瘤（OPA）是由β-反转录病毒属绵羊肺腺瘤病毒（JSRV）引起的一种肿瘤性传染病,该病潜伏期长,经呼吸道传播,冬季圈养种羊发病率高,目前无治疗措施,病死率为100%。OPA的持续存在对种羊生产形成了潜在威胁并造成较大经济损失,严重危害养羊业健康发展。所以,对OPA的早期精确诊断是防制本病的前提,尤其是在出入境检验检疫过程中对进出口羊的JSRV检测尤为重要。随着分子生物学技术的不断发展,JSRV分子生物学检测方法也得到不断的创新和改进。作者就近年来针对检测JSRV的聚合酶链式反应（PCR）、核酸探针杂交技术、酶联免疫吸附试验（ELISA）、环介导等温扩增技术（LAMP）等方法的研究概况作一综述,为寻找快速准确并适用于出入境检疫的JSRV检测方法和进一步发展研究新型JSRV检测方法提供参考。     

绵羊肺腺瘤病研究进展

绵羊肺腺瘤病 ( OPA)是由外源性的 D型和 B型绵羊肺腺瘤反转录病毒 ( JSRV)引起的肺脏肿瘤性疾病 ,该病毒主要在肺肿瘤上皮细胞内高水平表达 ,病毒基因组内 L TR的活化和病毒囊膜蛋白的表达是引起体外细胞转化癌变的主要因素 ,其致瘤的可能机制是通过激活磷酯酰肌醇 3 -激酶 ( PI-3 K)和蛋白酶 K( AKT)信号通路来启动细胞内抑制细胞凋亡和刺激细胞增生的信号转导系统 ,从而引起细胞增生癌变。该病与人的细支气管 -肺泡癌 ( BAC)极相似 ,通过对 OPA的研究 ,不仅为早期诊断及预防该病提出新方法 ,而且为揭示 BAC的分子发病机制及探索其基因治疗提供新思路。     

德克赛尔杂交绵羊肺腺瘤的诊断

绵羊肺腺瘤(OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)引起的一种可感染绵羊和山羊肺脏的肿瘤性疾病,近几年国内陆续有绵羊感染的报道,给国内的齐羊业造成巨大的经济损失.对山东某肉羊养殖场的发病羊进行临床症状观察,病理剖检及实验室诊断,通过外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV)套式RT-PCR检测方法,确诊发病绵羊为绵羊肺腺瘤病毒...     

1株山羊内源性肺腺瘤反转录病毒的序列测定与分析

参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20(EF680302.1)全基因组序列设计合成3对引物,以山羊基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增山羊内源性病毒基因片段,分别连接PMD-18T载体并测序,完成了1株山羊内源性肺腺瘤反转录病毒全基因序列的测定。结果分析显示测定序列全长7 480bp,获得的序列与内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-18(EF680301.1)的核苷酸相似性为93.4%,与外源性绵羊肺腺瘤病毒株JS-7(AF357971.1)的核苷酸相似性为88.1%。根据pro基因序列构建系统进化树,结果显示扩增序列与内源性绵羊反转录病毒株en-JSRV-5(EF680305.1)的亲缘关系最近。本研究有助于内源性肺腺瘤反转录病毒感染性克隆的构建和内源性肺腺瘤反转录病毒功能的研究。     

内源性绵羊肺腺瘤病毒全基因组序列测定与序列分析

参照内源性绵羊肺腺瘤病毒株enJSRV-20全基因组序列设计合成3对引物,应用PCR技术扩增内源性绵羊肺腺瘤病毒基因片段分别连接pMD-18T载体并测序,完成了内源性绵羊反转录病毒基因组序列测定。分析结果显示,测定序列全长7519bp,与内源性绵羊肺腺瘤病毒代表株enJSRV-20核苷酸同源性为99．4％,与外源性绵羊肺腺瘤病毒代表株AF357971．1的核苷酸同源性为90．4％。基于全基因组序列核苷酸的系统进化发生树分析结果显示,扩增序列与enJSRV-20的亲缘关系最近。     

绵羊肺腺瘤病毒致瘤机制研究进展

绵羊肺腺瘤(OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(OPAV)引起的一种慢性、传染性绵羊肺脏肿瘤性疾病,该病对养羊业,特别是种羊的发展有重大影响,世界动物卫生组织将其列为必须通报的动物疫病。论文就近年来国内外关于OPAV致瘤机制的相关研究进行了综述,包括OPAV的转录特异性和囊膜蛋白的致瘤作用和OPAV受体等。这对深入研究OPAV的致瘤机制及确定相应的防控靶点,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。     

表达绵羊肺腺瘤病毒跨膜蛋白HepG2细胞系的建立

为深入研究绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)与绵羊肺腺瘤病(OPA)发病关系,本研究采用PCR方法从pGEX-4T-1-TM重组质粒中扩增编码JSRV跨膜蛋白(TM)的基因序列,并引入标签多肽HA序列和限制性内切酶位点,将其重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组质粒pcDNA-TM-HA.通过转染HepG2细胞并用G418筛选,对稳定表达TM的阳性细胞进行纯化,获得了稳定表达JSRV tm基因的HepG2细胞系.间接免疫荧光及western blot检测结果表明,重组蛋白TM-HA在HepG2细胞中得到正确表达.JSRV TM蛋白稳定表达细胞系的建立为进一步研究该蛋白与JSRV诱导OPA发病关系提供了重要的实验平台.     

妊娠早期蒙古绵羊子宫内膜enJSRV及IFN-τ基因表达水平的分析

本研究旨在检测内源性绵羊肺腺瘤反转录病毒(enJSRV)与干扰素-τ(IFN-τ)在妊娠早期蒙古绵羊子宫内膜组织的表达以及enJSRV的表达与外周血孕酮水平变化的关系。运用TaqMan实时荧光定量PCR技术和电化学发光法对enJSRV和IFN-τ在妊娠早期蒙古绵羊子宫内膜组织相对表达及孕酮水平进行了测定。实时荧光定量PCR结果显示,enJSRV和IFN-τmRNA在妊娠早期绵羊子宫内膜组织有不同程度的表达。SAS统计学软件分析得出,子宫内膜组织中enJSRV mRNA在妊娠12～14d(交配日为0d)表达较高,2～10、16～30d的表达均低于前者。IFN-τmRNA仅在妊娠12～25d表达,14d达其峰值,30d就不能检出,且差异都极显著(P<0.01)。电化学发光法结果显示,孕酮水平在妊娠2d为0.4ng·mL-1,以后升高,妊娠8～16d维持在8.3ng·mL-1左右,在妊娠19～30d孕酮水平有所下降,30d为2.5ng·mL-1。以上结果提示,子宫内膜组织中enJSRV mRNA的表达与外周血孕酮含量及IFN-τ的变化高度相关,且enJSRV在胎盘的形态发生及生殖生物学方面发挥重要作用。     

绵羊肺腺瘤病毒内蒙古株的分离与观察

以内蒙古某羊场自然感染绵羊肺腺瘤病的病肺组织4例和3月龄绵羊胎肺2例作为材料，对胎肺细胞进行了原代培养并接种绵羊肺腺瘤病毒悬液，进行了绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)的分离，同时采用电镜负染色技术和超薄切片透射电镜技术对上述样品进行了观察。结果表明，自然感染绵羊肺腺瘤病的4例病肺组织中都有散在的病毒粒子，其直径为100～125nm，接种病毒悬液的胎肺细胞从第2代到第9代均出现细胞病变，但对绵羊胎肺培养的病毒悬液电镜负染色观察未发现典型的病毒粒子，而超薄切片透射电镜观察发现了病毒样粒子。     

绵羊肺腺瘤病毒实时荧光PCR检测方法的建立

为建立绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据JSRV的ag基因,选取其保守序列作为检测目的片段,设计并合成相应的引物和TaqMan探针,以自然病例的肺肿瘤组织基因组DNA为模板,经PCR扩增目的基因构建重组质粒pMD-gag,并将其作为阳性标准品,梯度稀释建立标准曲线,得到扩增方程为:y=-0.304x+38.4,扩增效率为100％,线性相关系数为0.999,该方法最低检出量为103拷贝,与其它病原核酸样品无交叉反应,其变异系数在1.374％以内.本研究为快速检测JSRV以及组装检测试剂盒奠定了基础.     

绵羊肺腺瘤病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)方法,根据外源性JSRV-NM株env基因序列,选其保守序列作为目的片段,设计引物和TaqMan探针,以自然病例的肺肿瘤组织基因组DNA为模板,经PCR扩增目的基因、克隆,重组质粒鉴定,并严格定量后,梯度稀释作为阳性标准品,优化反应条件进行Real-time qPCR扩增,获得的标准曲线为:Y=-3.308X+47.848,线性相关系数为0.991;Ct值变异系数小,并且灵敏度高,初步建立了检测JSRV前病毒DNA的Real-time qPCR方法。应用该方法对不同来源(A、B、C、D、E组)的绵羊外周血及其他组织样品进行测定其前病毒载量。结果显示B组和C组外周血白细胞、肺脏、肺门淋巴结以及鼻液中检测均为阳性,并发现前病毒DNA的载量在肺脏中明显高于外周血白细胞;D组虽未发现有绵羊肺腺瘤(SPA)临床症状,但在肺门淋巴结里可以检测到;E组中1只绵羊的肺脏也检出低拷贝数的前病毒DNA,而在A组中检测结果均为阴性。本研究对检测未知羊群JSRV感染程度及研究SPA流行病学等均有重要意义。     

Jaagsiekte sheep retrovirus found in milk macrophages but not in milk lymphocytes or mammary gland epithelia of naturally infected sheep

Jaagsiekte sheep retrovirus (JSRV) causes ovine pulmonary adenocarcinoma. JSRV can be transmitted via infected colostrum or milk, which contain somatic cells (SCs) harboring JSRV provirus. Nevertheless, the cell types involved in this form of transmission and the involvement of the mammary gland remain unknown. We separated adherent cells (macrophages and monocytes) by plastic adherence, and lymphocytes (CD4+ and CD8+ T cells, and B cells) by flow cytometry, from SCs in milk samples from 12 naturally infected, PCR blood test JSRV–positive, subclinical ewes. These cell populations were tested by PCR to detect JSRV provirus. The ewes were euthanized, and mammary gland samples were analyzed immunohistochemically to detect JSRV surface protein. We did not detect JSRV provirus in any milk lymphocyte population, but milk adherent cells were positive in 3 of 12 sheep, suggesting a potential major role of this population in the lactogenic transmission of JSRV. Immunohistochemistry did not reveal positive results in mammary epithelial cells, pointing to a lack of participation of the mammary gland in the biological cycle of JSRV and reducing the probability of excretion of free viral particles in colostrum or milk.     

内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因的克隆及序列分析

参照GenBank上已发表的内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因与5′长末端重复序列保守区序列设计引物,应用PCR技术成功扩增出内源性绵羊肺腺瘤env基因与5′长末端重复序列,将纯化的扩增片段连接pMD18-T克隆载体进行测序获得目的基因序列。应用MEGA4.1、DNASTAR进行序列分析,分析结果表明,内源性env基因具有完整的开放阅读框,内源性env基因序列与内源性绵羊肺腺瘤(AF153615.1)基因同源性高达99.7%,与外源性绵羊肺腺瘤(M80216.1)基因的同源性仅为90.6%;由内源性env基因推导的氨基酸在NCBI进行BLAST比较:与AF153615.1的氨基酸同源性高达100%。内源性env基因编码表达的蛋白具有亲水性。这些结果为研究5′长末端序列对内源性env基因调控等问题提供了重要参考。     

内源性绵羊肺腺瘤病毒NM株pol基因的克隆与序列分析

参照GenBank中内源性绵羊肺腺瘤病毒enJS56A1株pol基因序列设计了2对引物。应用PCR技术特异性地扩增出病毒的pol基因片段,将其克隆到PMD19-T载体后测序。应用计算机软件将测定序列与内源性南非代表毒株enJS56A1(AF153615)的pol基因序列比较,核苷酸同源性为99.3%,推导出的氨基酸同源性为95.0%。与外源性南非代表株JSRV-SA(M80216)的pol基因序列比较,核苷酸同源性为99.0%,氨基酸同源性为99.3%。这也是我国首次报道的内源性绵羊肺腺瘤病毒pol基因序列,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定基础。     

绵羊肺腺瘤病毒中国NM株gag基因3''''端951 bp段的分子克隆与序列分析

究参照Genebank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的全基因序列,设计合成一对引物,对JSRV中国NM株的gag基因3'端中主要编码核衣壳(NC)蛋白的基因段进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现一条约951 bp的特异条带,将其回收后克隆人pMD-18T载体中,并进行序列测定.结果表明,与南非代表株(基因序列号NC-001494)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为95.4%,推导出的氨基酸同源性为95%.与美国代表株(基因序列号AF105220)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为91.3%,氨基酸同源性为91%.这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的一段序列,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定基础.     

绵羊肺腺瘤病病毒NM株衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

为了建立原核高效表达体系,从自然感染绵羊肺腺瘤病病毒内蒙（NM）株的肺肿瘤组织中提取基因组DNA,应用PCR技术扩增编码gag基因衣壳蛋白（Capsid protein,CA）基因,构建CA蛋白的重组表达质粒pGEX-4T-1-CA,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转化入Ecoli BL21 CodonPlus中,在IPTG的诱导下表达,表达产物用SDS-PAGE分析鉴定。结果表明,该基因可以在大肠杆菌中以可溶性和包涵体形式高效表达,表达的CA融合蛋白表观分子量约为37 Ku,表达量占全菌蛋白的20%,利用谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析柱纯化可以得到具有较高纯度的表达蛋白,是一种理想的免疫原。本研究为下一步利用重组蛋白研制绵羊肺腺瘤病病毒NM株的单克隆抗体及诊断试制盒等奠定了基础。     

内源性绵羊肺腺瘤病毒NM株gag基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

提取内源性绵羊肺腺瘤病毒内蒙古分离株（NM）总DNA，参照GenBank中内源性绵羊肺腺瘤病毒enJS56A1株gag基因序列设计1对引物。应用PCR技术特异性地扩增出病毒的gag基因片段，将其克隆到pMD19-T载体中进行测序得到完整的gag基因序列，并用DNAStar软件进行序列分析，分析结果表明，与内源性南非代表毒株enJS56A1（AF153615）的gag基因序列比较，核苷酸同源性为98．9％，推导出的氨基酸同源性为98．4％。与外源性美国代表株JSRV21（AF105220）的gag基因序列比较，核苷酸同源性为89．6％，氨基酸同源性为94．8％。利用生物信息学软件对其蛋白结构进行预测，结果表明gag-enJSRV-NM为一结构松散的蛋白分子，这也是我国首次报道的内源性绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的全序列，为我国科研工作者进行更深入的研究奠定了基础。