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1.
《湖南农业大学学报(自然科学版)》2015,41(4)
为探索辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMo V)的分子杂交技术检测方法,以感病辣椒叶片为试材,用改良CTAB法从辣椒叶片中提取总核酸,运用RT–PCR技术扩增出PMMo V特异片段。以带有PMMo V特异片段的质粒DNA为模板,以用PCR技术制备的地高辛标记PMMo V c DNA探针检测PMMo V。结果表明:1)干燥叶片、新鲜叶片中提取的总核酸稀释80、640倍(相当于12.5、1.60μg叶片)后仍可检测到其中的PMMo V;干燥叶片利于保存及长距离转运,利于对大批量样品进行集中检测;2)采用快速提取法提取叶片总核酸,可从稀释80倍(约12.5μg叶片)的总核酸样品中检测到PMMo V。该技术体系可基本满足常规检测试验的需要。 相似文献
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鹦鹉幼雏病是由禽类多瘤病毒(APV)引起的多种鹦鹉雏鸟死亡的急性病毒性传染病,严重危害鹦鹉养殖业的健康发展。为提高分子生物学方法检测APV的敏感性和特异性,对APV基因片段进行克隆和序列分析,设计合成1对特异性引物,以VP1基因为模板,经PCR扩增获得731 bp的核苷酸DNA,并用DIG标记,制备用于检测APV的特异性核酸探针;对制备的探针进行灵敏度检测,同时与普通PCR进行敏感性比较;使用制备的探针,对经分离鉴定和制备保存的其他7种禽病毒核酸进行特异性检测;用该核酸探针,对疑似感染APV的鹦鹉病料进行斑点杂交检测,并对鉴定为阳性的APV进行全基因组扩增和序列分析。结果显示:该探针可检测到2 pg量的APV特异性核酸片段;仅APV-VP1阳性核酸显色,呈现阳性反应,而阴性核酸和其他7种禽病毒核酸均不显色,呈阴性反应。结果表明:建立的核酸斑点杂交检测方法具有较高的灵敏度和特异性,可用于临床初步诊断。本方法的建立为我国开展APV分子流行病学调查及其感染的临床诊断提供了技术支撑。 相似文献
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地高辛标记核酸探针检测牛粘膜病病毒 总被引:7,自引:1,他引:6
本课题建立了地高辛标记核酸探针检测牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)的诊断方法。根据BVDV基因序列的结构特点,在编码非结构蛋白p125高度保守基因区内,设计合成一对特异性引物。以PCR技术从BVDV基因重组质粒中扩增出了BVDV特异的、保守的400bp核苷酸片段,经纯化后,地高辛标记,制备牛病毒性腹泻病毒的特异性核酸探针。通过检测BVDV细胞培养物、相关病毒及核酸载体和BVDV细胞培养物的总R 相似文献
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鸡传染性喉气管炎病毒gB基因核酸探针的研究 总被引:7,自引:0,他引:7
郭霄峰 《华南农业大学学报》1997,18(3):105-109
将插有传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白B(gB)基因的重组质粒pILgB克隆,然后用碱法抽提,乙醇沉淀。质粒pILgB经EcoRI酶切后,用地高辛标记,获得ILTVgB基因的核酸探针。该探针分别与传染性喉气管炎病毒,传染性支气管炎病毒,传染性法氏囊病毒,禽流感病毒,马立克氏病病毒,新城疫病毒核酸斑点杂交,发现只有传染性喉气管炎病毒的核酸有阳性反应,说明该探针对ILTV有高度的特异性。gB基因核酸探针与不同浓度的核酸杂交,能检出0.01μg的核酸,表明该探针高度敏感。实验结果还显示,探针能重复多次使用,检测效果不变。 相似文献
5.
为评价PCR结合斑点杂交技术在鸡REV检测中的应用价值,采用PCR法制备禽网状内皮细胞增生症病毒特异性地高辛标记DNA探针,同时用PCR技术、斑点杂交方法和PCR产物斑点杂交方法检测了不同地区的病、死鸡的组织样品REV的感染情况。结果表明,PCR产物斑点杂交法的检出率(45.16%,14/31)高于组织DNA直接斑点杂交法(32.26%,10/31),显著高于单纯PCR扩增法(0%,0/31)。PCR结合斑点杂交检测技术能快速、敏感、准确,充分避免PCR中的假阴性和假阳性现象,值得推广应用。 相似文献
6.
试验旨在建立重组人白细胞介素1受体颉颃剂(interleukin-1 receptor antagonist,IL-1ra)原液中宿主菌DNA残余量的检测方法。以重组白细胞介素1受体颉颃剂工程菌基因组DNA为模板,优化试验条件,借助超声波手段,制备地高辛标记的核酸探针, 并以此探针进行狭缝杂交及显色反应。结果显示,在24 批次重组人IL-1ra原液中,每人份使用剂量的宿主DNA残余量均小于10 ng。结果表明,该方法灵敏度较高、特异性较强、重复性较好、操作步骤安全且较为方便,可用于重组人IL-1ra原液及半成品的DNA残余检测。 相似文献
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OBP是蚜虫嗅觉功能中的一类重要分泌蛋白,能选择性地结合气味分子并进行信号转导。本试验使用显微注射法将麦长管蚜OBP7的小干扰RNA(siRNA)导入麦长管蚜体内,通过qRT-PCR检测OBP7mRNA相对表达量的变化情况。结果发现在siRNA浓度0.32μg/μL,注射量23nL,注射后24h,麦长管蚜成蚜的mRNA相对表达量降低到37.1%,证明了显微注射方式进行RNA干扰的可行性。在注射23nL的siRNA-467,经过36h后,麦长管蚜出现了对EβF趋性行为的改变(P0.05),表明OBP7蛋白在麦蚜对EβF的识别过程中具有重要作用。 相似文献
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地高辛标记DNA分子中W316bp特异片段成探针的研究 总被引:4,自引:1,他引:3
以W(5‘-CGGCCCCGGT-3‘)为随机引物通过RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)-PCR扩增技术从高产王浆西峰的不同三品系(浙农大、平湖和萧山等意峰)的DNA分子中获得的共同特异W316bp(bp,base pair)片段,用非放射性标记物地高辛(digoxigenin,DIG)使用随机引物标记法制备成DIG-W316bp探针。结果:此探针可与高产王浆西蜂的DNA基因组及扩增产物分别进行斑点杂交、Southern杂交以此鉴定高产王浆西蜂。 相似文献
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禽传染性喉气管炎病毒TK基因狄高辛探针的研制及应用 总被引:1,自引:0,他引:1
应用狄高辛标记禽传染性喉气管炎病毒(AILTV)TK基因制备探针,经斑点杂交显色后,探针同以AILTV北京株为模板的TK基因PCR产物及北京株核酸均呈阳性紫色斑点,而与正常尿囊液、新城疫病毒和火鸡疱疹病毒、禽传染性支气管炎病毒无反应,2株确诊为AILTV的野外分离毒也呈阳性。本研究结果表明,该TK基因探针是敏感和特异的,可用于禽传染性喉气管炎和其它呼吸道疾病的鉴别诊断。 相似文献