原位杂交技术在水产动物育种与疾病诊断中的应用

原位杂交技术作为分子杂交的基本原理和免疫组织化学两者相结合的一项技术，有很高的应用价值，其中地高辛标记物凭借其系统安全、方便、省时，敏感性和质量控制优于生物素标记和放射性物质标记技术，被广大研究者认可。本文重点介绍了地高辛原位杂交的原理，概括了其在水产动物育种与疾病诊断中的应用现状。     

原位杂交技术及其在水产养殖中的应用

原位杂交技术是近年来快速发展起来的一门新技术。本文介绍了原位杂交技术的基本原理和几种常用的原位杂交技术,并概述了原位杂交技术在水产养殖中的应用现状,包括该技术在基因定位、性别鉴定和病毒检测等领域的应用。此外,还对该技术的应用前景进行了展望。     

养殖刺参“腐皮综合征”致病菌——灿烂弧菌的原位杂交检测方法的建立与应用

以养殖刺参“腐皮综合征”的重要致病菌——灿烂弧菌Vibrio splendidus的16S~23S间隔区序列,设计特异性引物,用PCR方法制备地高辛(DIG)标记探针,建立了原位杂交技术检测感染刺参体内灿烂弧菌的技术方法,并利用该方法对人工感染刺参和健康刺参各组织进行检测。结果显示,感染刺参的体壁结缔组织、肌肉组织、肠粘膜上皮、辐水管等组织的原位杂交检测呈阳性,而与健康刺参组织无交叉反应。在感染组织中,阳性信号（显色）强弱清晰,能准确反映出灿烂弧菌的侵染部位及感染程度,这为探明灿烂弧菌的感染途径、感染病程等致病机理研究奠定了基础,也为养殖刺参疾病预防和健康管理提供了技术支撑。     

荧光原位杂交技术的研究及其应用

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是现代分子生物学及基因工程中广泛应用的新技术,它可以鉴定核酸分子之间的同源性。荧光原位杂交技术是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法。综述了荧光原位杂交技术的原理、应用及其前景。     

金鱼DEAD-box家族基因p68和p110在配子发生中的表达特征

利用组织原位杂交技术，以地高辛标记的反义RNA为探针，检测了金鱼（Carassius auratus）DEAD-box家族基因p68和p110在卵子发生及精子发生中的表达分布特点。结果表明：在金鱼配子发生中，p68基因在各个时期的卵母细胞均有表达，Ⅰ、Ⅱ期卵母细胞中的表达水平较Ⅲ、Ⅳ期卵母细胞中更高。p68基因的表达只限于精原细胞和初级精母细胞中，p110基因在金鱼精子发生各阶段持续表达，其中精原细胞和初级精母细胞中表达水平较高；在卵子发生中，Ⅰ期卵母细胞中没有p110 RNA阳性信号，Ⅱ期卵母细胞中信号较为强烈，但在Ⅲ、Ⅳ期卵母细胞中杂交信号明显减弱。     

SCP3作为栉孔扇贝初级精母细胞标记分子的研究

为检验SCP3在无脊椎动物中是否可以标记特定的生殖细胞,实验利用RACE技术克隆了栉孔扇贝SCP3(Cf-SCP3)的全长cDNA序列,结果显示,其长度为1 033 bp,开放阅读框为726 bp,编码241个氨基酸。推导的氨基酸序列中包含SCP3保守的Cor1结构域和卷曲螺旋结构域。制备了Cf-SCP3地高辛标记的RNA探针和Cf-SCP3重组蛋白的多克隆抗体,采用原位杂交和免疫组织化学技术检测其细胞学定位,结果显示Cf-SCP3转录本和Cf-SCP3蛋白均特异性地定位在栉孔扇贝的初级精母细胞和未受精卵中,在精巢的其他类型细胞和卵巢中均未见表达信号。研究表明,Cf-SCP3蛋白可能与脊椎动物的SCP3蛋白一样,作为联会复合体的组成成分参与栉孔扇贝的配子发生,同时可以作为一个栉孔扇贝初级精母细胞的分子标记应用到体外诱导生殖细胞分化的研究。     

牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)间接原位杂交PCR检测方法的建立与初步应用

为建立实现牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在贝类宿主组织中的精确定位方法,基于原位杂交PCR (ISPCR)技术建立了OsHV-1的间接原位杂交PCR (indirect ISPCR)检测方法,并利用该方法对OsHV-1在魁蚶主要器官的分布情况进行了检测和分析。首先选择适合原位杂交PCR的引物,在载玻片上实现对原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,然后与使用相同引物制作的地高辛标记核酸探针进行原位杂交,最后通过免疫酶标技术显示样本内OsHV-1的组织分布。为了达到最佳检测效果,对间接ISPCR的扩增循环数以及组织消化的蛋白酶K浓度进行优化。结果显示,最适PCR扩增循环数为20,蛋白酶K浓度为20μg/mL。利用经优化的间接ISPCR检测方法,对OsHV-1在魁蚶外套膜、鳃、肝胰腺、斧足和闭壳肌5个样本中的组织分布情况和亲嗜性进行检测和分析。病毒阳性信号主要分布于魁蚶外套膜结缔组织中浸润的血细胞和成纤维细胞、肝胰腺和鳃浸润的血细胞、斧足和闭壳肌中坏死肌肉细胞的细胞核中。本研究建立的间接ISPCR检测方法具有灵敏、特异和精确定位的优点,通过组织切片上显示的病毒核酸阳性信号,能判别OsHV-1在不同组织部位的分布特点和受感染的细胞类型;适用于OsHV-1感染的确诊、病毒对不同组织器官的亲嗜性、病毒侵染途径和致病机理等相关研究。     

鱼类染色体核型分析方法概述

鱼类染色体原位杂交中使用较多的是C带、Q带和RE带等分带技术。分带主要和DNA变性、复性的速度、DNA螺旋化程度、DNA上A—T、G—C碱基的分布等因素有关。原位杂交技术及显微图像分析仪等现代手段使染色体显带技术有了进一步完善和提高，染色体核型分析研究由过去的以技术为主向以寻求适宜方法为主转变。     

荧光原位杂交技术在鱼类基因定位研究中的应用

荧光原位杂交fluorescence in situ hybridization,FISH）技术是一种简单而有效的染色体上物理定位DNA序列的技术。本文介绍了荧光原位杂交技术的基本原理以及实验流程,综述了近年来FISH技术在鱼类基因定位方面的应用,如来源于细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）文库的单拷贝基因的定位、核糖体基因和组蛋白基因等中度重复序列的定位、着丝粒特异序列和性别特异序列等高度重复序列的定位以及其他重复序列的定位等,用于研究特定基因定位、性染色体鉴定及种间杂交等遗传学问题,并展望了此技术在定位鱼类经济性状相关标记或基因、性别相关标记或基因及种特异染色体标记中的应用前景。     

荧光原位杂交概述

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记，     

DNA分子标记技术概述

综述了DNA分子标记技术的类型及代表性分子标记技术的基本原理和优缺点,对常用分子标记技术进行了对比,并对其发展趋势进行了展望。     

半滑舌鳎微卫星标记的开发及其在F1家系中分离方式分析

利用富集文库-菌落原位杂交的方法筛选半滑舌鳎( Cynoglossus semilaevis)微卫星标记,构建富含(AC)和(AG)序列重复的半滑舌鳎微卫星富集文库,随机从文库中挑选1060个克隆,筛选得到883个(83.3％)阳性信号,菌落PCR检测742个阳性克隆片段的长度在500～1 200 bp范围内,随机挑选其中50个克隆进行测序,共设计引物33对,进行退火温度优化、多态性检测后,共得到20个多态的半滑舌鳎微卫星标记.对其进行分离方式分析,其中有17个位点符合孟德尔分离定律,共表现5种分离方式,可用于半滑舌鳎遗传连锁图谱的构建；另外有3个位点偏离孟德尔分离定律(P＜0.05).结果同时证明富集文库-菌落原位杂交是半滑舌鳎微卫星标记大量筛选和高密度遗传连锁图谱构建的一种行之有效的方法.     

显微介导河蟹总DNA导入镜鲤的检测与分析

利用显微介导远缘杂交技术将河蟹总DNA直接导入镜鲤受精卵内,再利用AFLP分子标记技术检测显微介导河蟹基因镜鲤的外源DNA。在30对AFLP引物中,有3对引物扩增出供体基因片段,即在显微介导河蟹基因镜鲤中均有和河蟹基因相同而对照镜鲤没有的条带。对6尾阳性显微介导河蟹基因镜鲤的扩增产物进行回收、克隆和测序验证。结果表明:阳性显微介导河蟹基因在镜鲤中均含有供体基因目的片段。本研究在分子和基因水平上验证了河蟹总DNA可通过显微介导方式整合到镜鲤基因组中,为显微介导外源总DNA转化技术的应用提供新的思路。     

An improved in situ hybridization method for the detection of fish pathogens

A fluorescent in situ hybridization (FISH) method was developed for detection of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) in paraffin-embedded tissues of Atlantic salmon, Salmo salar L. Several methods of probe labelling and detection were evaluated and found unsuitable for FISH because of tissue autofluorescence. Likewise, the use of avidin to detect biotin-labelled probe was obviated by the presence of endogenous biotin. An existing approach, using digoxigenin (DIG)-labelled probes and detection by anti-DIG antibody-labelled with alkaline phosphatase, was modified to use a fluorescent substrate, 2-hydroxy-3-naphthoic acid-2'-phenylanilide phosphate/4-chloro-2-methylbenzene diazonium hemi-zinc chloride salt (HNPP/Fast Red TR). This improved method allowed sensitive detection of IPNV target, without interference from autofluorescence or endogenous alkaline phosphatase. Furthermore, the reporter produces a discrete, non-fading signal, which is particularly suitable for analysis by confocal microscopy.     

黑脊倒刺鲃vasa同源基因的克隆及表达分析

为了从分子水平上研究鱼类生殖细胞发育的机制,首次从重要的经济养殖鱼类——黑脊倒刺鲃中克隆了斑马鱼vasa的同源基因ScVHG。该cDNA长1962bp,编码654个氨基酸,氨基酸序列中含有DEAD蛋白家族特有的9个保守结构域。经比对发现,其编码的蛋白序列与斑马鱼VASA蛋白等具有高度的同源性,与斑马鱼、罗非鱼、虹鳟、银鲫、黄鳝、金鱼、金枪鱼、草鱼的VASA蛋白相似度分别为77%,77%,79%,90%,74%,89%,79%和86%。RT-PCR结果显示:在成鱼不同的组织中,ScVHG仅在精巢和卵巢中表达。RNA原位杂交结果进一步表明:在精子发生中,ScVHG只在精原细胞中表达,而在后期的精母细胞、精子细胞中均未发现明显的表达;在卵子发生中,ScVHG在卵原细胞和卵母细胞的各个时相中均有表达,在卵原细胞中表达最为强烈,而在随后各时相的卵母细胞中,阳性信号逐渐减弱。研究认为,该基因中含有的保守序列、序列的相似性以及该基因在生殖细胞中的特异性表达等结果均表明,克隆得到的ScVHG是斑马鱼vasa的同源基因,此基因可作为一种有效的分子标记,用于黑脊倒刺鲃以及其他鱼类生殖细胞发育机制的研究。     

核酸探针斑点杂交检测对虾传染性肌肉坏死病毒

通过PCR方法制备了对虾传染性肌肉坏死病毒地高辛标记探针,探针长度123 bp,通过核酸探针斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行验证.结果表明,该方法检测对虾传染性肌肉坏死病毒cDNA的检出灵敏度为108拷贝,可检出1拷贝的传染性肌肉坏死病毒cDNA的PCR产物.本方法可应用于健康亲虾、苗种的培育和无特定病原(SPF)对虾种群的选育及传染性肌肉坏死病毒流行病学调查,具有较高的应用价值.