SMAD2介导的Activin A信号对人胚胎干细胞向限定性内胚层细胞诱导分化的促进作用

【目的】研究SMAD2在Activin A促进人胚胎干细胞向限定性内胚层诱导分化中的作用。【方法】在人胚胎干细胞中转染SMAD2基因siRNA或者过表达质粒后,收集经Activin A分别诱导0,6,12,24,48,72,96和120 h的细胞各100 ng/mL,采用实时定量PCR检测SMAD2 与内中胚层共同前体标记Brachyury和内胚层标记Sox17的表达,进一步通过Western-blot分析Activin A诱导中SMAD2和磷酸化SMAD2（p-SMAD2）表达的变化。【结果】在Activin A诱导人胚胎干细胞向限定性内胚层细胞分化的过程中,干扰SMAD2 后48 h时才检测到Brachyury强表达,而单纯Activin A处理组24 h就检测到强表达;Sox17的表达始终较单纯Activin A处理组明显降低,因此,干扰SMAD2直接抑制了Activin A的诱导作用。而过表达SMAD2,Brachyury和Sox17的表达水平较单纯Activin A处理组明显增加,促进了限定性内胚层的发生;并且在Activin A诱导过程中,p-SMAD2的表达水平明显提高,而SMAD2的表达没有明显改变。【结论】SMAD2作为关键因子,介导了Activin A诱导人胚胎干细胞向限定性内胚层的分化,并转录调控Brachyury和Sox17的表达;SMAD2的磷酸化,激活并介导了Activin A诱导的信号转导通路。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus) Activin 基因两种β亚基的启动子克隆及生物信息学分析

以牙鲆为研究对象,利用染色体步移(Genome walking)获得了 Activin 两个β亚基基因的上游部分启动子序列,并对其进行了转录调控元件的生物信息学预测分析。获得了 Activin βA 和βB两个亚基的启动子部分序列,长度分别约为2.7 kb 和2.4 kb;在预测的 Activin βB 转录起始位点(+1位)的上游31 bp 处有1个典型的 TATA box,而在 Activin βA 中未发现 TATA box 的存在。两个基因的启动子上发现了多个转录因子 Sp1、Oct-1、C/EBP、CREB、GATA-1、HNF-3、HNF-1、USF 等结合位点,还发现了与内分泌相关的 Pit-1、ER、PR、GR、RAR、RXR 等结合位点,但肌性转录因子 MyoD、myogenin 和雄性的性别决定基因 SRY 结合位点仅在 Activin βA 启动子中发现。生物信息学分析显示,牙鲆 Activin βA 和βB 表达受到多种潜在因子的调控,二者在调控上有所差异。     

激活素Activin A对猪卵母细胞胞质成熟的影响

[目的]探讨体外成熟过程中在培养液中添加激活素Activin A对猪卵母细胞胞质成熟的影响。[方法]在TCM-199中添加不同剂量Activin A的培养猪卵母细胞40 h,以激光共聚焦显微镜观察到的着色的线粒体排布形态类型来判断卵母细胞胞质是否成熟。[结果]当Activin A剂量为100 ng/ml时,胞质中线粒体呈弥散型分布形态的卵母细胞数目极显著增加(P0.01),同时线粒体呈圆周型排布与半周型排布的卵母细胞数目显著下降(P0.05)。[结论]猪卵母细胞体外成熟过程中在成熟培养液中添加激活素Activin A,能促进卵母细胞胞质的成熟。     

Activin A促进未成年小鼠腔前卵泡发育的研究

Activin A(Act A)是一种由卵泡液中提取出来的蛋白,主要以旁分泌和自分泌途径调节卵泡颗粒细胞功能,但其对卵泡发育的影响却不十分清楚。本试验的主要目的就是探讨Act A对小鼠腔前卵泡发育的影响。本研究以60μg/kg剂量的Act A注射10日龄的母鼠,连续注射4d。收集卵巢后,进行HE染色;通过WST-1细胞增殖试剂盒,检测颗粒细胞的增殖情况。试验结果表明:Act A注射4d后,小鼠有腔卵泡比例为30.7±1.8%,对照组为12.9±7.2%(p<0.01),实验组有腔卵泡细胞直径增加到169.33±4.2μm,对照组的为158.05±2.8μm(p<0.01)。颗粒细胞的增殖情况差异不显著,注射Act A组的吸光度为0.47±0.07,对照组的为0.51±0.11,p>0.05。本研究认为,Act A促进未成年小鼠卵巢卵泡中颗粒细胞分化,从而促进有腔卵泡的形成。     

Gonadotropins and their paracrine signaling network in the zebrafish ovary

Pituitary gonadotropins, follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH), play fundamental roles in vertebrate ovarian development and function. However, there has been an increasing body of evidence that the actions of FSH and LH are mediated or modulated by a variety of locally produced peptide or protein factors, which form an intimate regulatory network within and between the ovarian follicles. In the past few years, a variety of growth factors have been identified and characterized in the zebrafish ovary including activin and epidermal growth factor (EGF), which are important components of the intraovarian communication network. To understand how this local network interacts with the gonadotropins from the pituitary, we have recently cloned and characterized all the subunits of zebrafish FSH and LH from the pituitary as well as their receptors (FSHR and LHR) from the ovary. Using the Chinese hamster ovary (CHO) cells as the bioreactor, we have produced recombinant zebrafish FSH and LH with biological activities. With the recombinant hormones available, the functions of zebrafish FSH and LH in the ovary and their interactions with the local factors will be an important issue to address in the future. This review briefly summarizes some recent work from our laboratory and others on both gonadotropins and their potential intraovarian signaling factors in the zebrafish.     

Wnt3a和Activin A共同促进人胚胎干细胞向限定性内胚层细胞分化

【目的】研究Wnt3a和Activin A在限定性内胚层诱导中共同作用的最佳时间窗。【方法】在无饲养层体系培养的人胚胎干细胞中,加入25 ng/mL Wnt3a和100 ng/mL Activin A,共同作用不同时间(1~4 d),收集不同作用时间点(0,1,2,3,4,5 d)细胞,对原条、内中胚层前体标记Brachyury及限定性内胚层标记Sox17分别进行免疫荧光染色,统计阳性细胞总数,计算阳性细胞率。以看家基因β-actin作为对照,采用RT-PCR方法对原肠作用基因(Goosecoid(GSC)、Mixl1)及三胚层发育相关基因(内胚层基因Sox17、Foxa2,内中胚层前体基因Brachyury,中胚层基因Flk-1,外胚层基因Pax6,胚外内胚层基因Sox7、CDX2)的表达进行检测。【结果】Wnt3a与Activin A共同作用1~4 d,均能获得限定性内胚层细胞,其中二者共同作用1 d分别能获得(78.9±7.3)%Brachyury阳性细胞和(85.2±3.8)%的Sox17阳性细胞。RT-PCR结果显示,在Wnt3a与Activin A共同作用下,原肠作用基因及三胚层发育相关基因表达的时间有差异。【结论】Wnt3a和Activin A共同作用1 d,是有效促进人胚胎干细胞向限定性内胚层细胞分化的最佳作用时间窗。     

Activin A特异性对人胚胎干细胞向限定性内胚层诱导分化的促进作用

【目的】研究Activin A对人胚胎干细胞（hESCs）向限定性内胚层（DE）诱导分化的促进作用及其信号通路分子,为hESCs向DE诱导分化体系的优化提供参考。【方法】在人饲养层体系培养的hESCs中,收集100 ng/mL Activin A分别诱导0,6,12,24,48,72,96,120 h的细胞,用实时荧光定量RT-PCR检测原条标记Gsc和Mixl1、中内胚层共同前体标记Brachyury、内胚层标记Foxa2和Sox17、中胚层标记Flk1、外胚层基因Pax6、多能性相关基因Oct4与Nanog表达水平的变化,用细胞免疫荧光检测Brachyury和Sox17蛋白表达水平的变化。【结果】在人饲养层（HEF）培养体系上,高浓度Activin A能更快地促进中内胚层基因的表达并提高其表达水平;Brachyury和Sox17蛋白的细胞免疫荧光检测表明,Activin A诱导12和48 h就可检测二者的表达明显增加,且二者的表达水平分别在诱导48和96 h时达到高峰;hESCs高效分化为限定性内胚层细胞,DE细胞分化率为（81.7±5.4）%,并且体外的内胚层分化过程遵循从原条开始、经过中内胚层共同前体阶段、再到内胚层的发育过程,与体内发育规律相似。【结论】Activin A能特异性地诱导人胚胎干细胞向限定性内胚层分化,转录调控Brachyury和Sox17蛋白的表达。     

牙鲆(Paralichthys olivaceus) Activin基因两种β亚基的启动子克隆及生物信息学分析

以牙鲆为研究对象,利用染色体步移(Genome walking)获得了Activin两个β亚基基因的上游部分启动子序列,并对其进行了转录调控元件的生物信息学预测分析。获得了Activin βA和βB两个亚基的启动子部分序列,长度分别约为2.7 kb和2.4 kb;在预测的Activin βB转录起始位点(+1位)的上游31 bp处有1个典型的TATA box,而在Activin βA中未发现TATA box的存在。两个基因的启动子上发现了多个转录因子Sp1、Oct-1、C/EBP、CREB、GATA-1、HNF-3、HNF-1、USF等结合位点,还发现了与内分泌相关的Pit-1、ER、PR、GR、RAR、RXR等结合位点,但肌性转录因子MyoD、myogenin和雄性的性别决定基因SRY结合位点仅在Activin βA启动子中发现。生物信息学分析显示,牙鲆Activin βA和βB表达受到多种潜在因子的调控,二者在调控上有所差异。     

梅花鹿激活素A重组蛋白真核表达、纯化 及其生物活性的测定

【目的】体外真核表达梅花鹿（Cervus nippon）激活素 A重组蛋白并测定其生物活性,为进一步明确激活素 A在梅花鹿卵母细胞体外成熟过程中的生理学功能提供基础。【方法】利用RT-PCR技术克隆梅花鹿激活素βA (Activin βA, ACTBA)亚基基因的cDNA 全长序列,同时利用生物信息学对梅花鹿激活素βA的基因特征进行分析。在NCBI 数据库下载其他物种激活素βA同源序列,利用Clustalx和MEGA 4 软件进行同源比对并构建进化树。构建pcDNA4/ACTBA重组质粒并转染至CHO细胞内,进行目的蛋白的体外表达。采用免疫荧光及Western blot 技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA 亲和层析柱对蛋白产物进行纯化。采用Western blot检测了梅花鹿激活素 A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中的SMAD2和SMAD3的磷酸化水平。最后采用荧光定量PCR及Western blot检测了梅花鹿激活素 A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中类固醇激素合成相关酶的表达量。【结果】克隆得到的梅花鹿ACTBA亚基基因含有1 278 bp 的碱基,编码426个氨基酸。同源性比较发现梅花鹿ACTBA基因与牛的ACTBA基因同源性最高达98.4%同源。进化分析表明该基因与同为偶蹄目动物的反刍兽牛和山羊亲缘关系最为接近。经酶切、PCR和测序方法鉴定,成功构建真核表达质粒pcDNA4/ACTBA。免疫荧光显示该质粒在CHO细胞中主要定位在细胞质。Western blot 结果显示激活素 A的前体蛋白分子量约为58 kD左右。镍亲和层析纯化后的激活素 A重组蛋白显著增加SMAD2和SMAD3的磷酸化,表明激活素 A可以激活SMAD信号通路。同时成熟的激活素 A重组蛋白可以诱导猪颗粒细胞芳香化酶(Aromatase)蛋白表达量上调,类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein, StAR)表达量下调,FSH受体基因表达量升高,LH受体基因表达量降低,但胆固醇侧链裂解酶(Cholesterol side-chain cleavage enzyme, CYP11A1 or P450scc)及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-Hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)基因表达量不变。结果表明梅花鹿激活素 A重组蛋白可以增强FSH对颗粒细胞的生物学作用,也可以减弱LH对颗粒细胞的生物学作用。【结论】成功构建了激活素 A蛋白的真核表达载体,并获得了较高纯度的、具有生物学活性的梅花鹿激活素 A重组蛋白,为下一步激活素 A蛋白的生物学功能和生理学机制研究奠定了基础。     

仙居鸡抑制素/活化素β_A亚基成熟区的cDNA克隆及序列分析

本研究根据发表的来航鸡抑制素 /活化素βA 亚基序列设计引物 ,运用RT PCR技术从仙居鸡卵泡的颗粒细胞总RNA中扩增出抑制素 /活化素βA 亚基成熟区序列 ,并进行了克隆和测序。结果显示 ,所测鸡成熟βA 亚基是由 116个氨基酸 (aa)残基组成的蛋白质 ,共有 9个半胱氨酸残基 ,与发表的鸡及哺乳类相应序列对比 ,其核苷酸序列的同源性分别为 99.2 %和 81%～ 85 .2 % ,其预测氨基酸序列的同源性分别为 10 0 %和 96 .6 %～ 97.4 % ,且所测鸡 βA 亚基成熟区半胱氨酸残基的数目和位置与发表的鸡和哺乳类相同 ,说明该亚基的序列及结构在不同物种间具高度保守性 ,揭示其可能具重要的生理功能