外源添加山梨醇和海藻糖对意大利蜜蜂抗寒性能的影响

本试验旨在通过测定意大利蜜蜂(简称意蜂)体内山梨醇、海藻糖等相关生化物质含量、抗氧化酶活性及抗寒基因表达的变化,探究外源添加山梨醇和海藻糖在蜜蜂抗寒过程中的作用机制。从意蜂姊妹蜂群中随机选取900只刚出房的蜜蜂,随机分成6组,每组3个重复,每个重复50只蜜蜂,分别饲喂蔗糖溶液(对照)、海藻糖溶液和山梨醇溶液。6组均于常温(30℃)下饲养12 d,其中3组在饲喂12 d后进行冷处理(4℃冷驯化2 h)。饲喂12 d后立即测定蜜蜂过冷却点、冰点,比较其抗寒性能差异。然后分别测定蜂体游离水、糖原、脂肪含量、山梨醇脱氢酶(SDH)、海藻糖酶(THL)活性以及海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)、SDH mRNA相对表达量的差异;另取900只意蜂,按照以上分组饲养,用于测定血淋巴中小分子糖醇含量。结果表明:1)与对照组相比,山梨醇组和海藻糖组过冷却点分别降低0.65(P0.05)、0.41℃(P0.05)。2)与对照组相比,常温以及冷处理条件下,山梨醇组和海藻糖组蜂体游离水含量变化不显著(P0.05)。3)与对照组相比,常温以及冷处理条件下,海藻糖组和山梨醇组蜂体内脂肪含量变化不显著(P0.05),而糖原含量显著提高(P0.05)。4)与对照组相比,常温以及冷处理条件下,山梨醇组和海藻糖组血淋巴中葡萄糖含量显著增加(P0.05);常温条件下,山梨醇组血淋巴中果糖含量显著提高(P0.05),而冷处理条件下,海藻糖组血淋巴中果糖含量显著降低(P0.05);常温条件下,山梨醇组血淋巴中山梨醇含量显著增加(P0.05),而冷处理条件下,结果差异不显著(P0.05)。5)与对照组相比,常温以及冷处理条件下,山梨醇组和海藻糖组蜂体SDH和THL活性均显著提高(P0.05)。6)与对照组相比,常温以及冷处理条件下,山梨醇组SDH mRNA相对表达量显著上调(P0.05);常温条件下,海藻糖组TPS mRNA相对表达量显著下调(P0.05)。综上所述,在室内饲养的离群意蜂外源添加山梨醇、海藻糖显著降低了意蜂的过冷却点、冰点,进而提高了抗寒性。山梨醇和海藻糖通过调节意蜂血淋巴中小分子糖醇含量,以及与山梨醇、海藻糖代谢通路相关的基因表达量来提高蜜蜂的抗寒性。     

两个褐飞虱海藻糖转运蛋白基因的结构及调控海藻糖代谢功能

【目的】海藻糖是昆虫中的主要血糖物质,在昆虫的发育及生理活动中发挥重要功能。其中,海藻糖转运蛋白（Tret）在将海藻糖从其生成组织（例如脂肪体）运输到其消耗组织的过程中起着重要作用。本研究通过分析褐飞虱（Nilaparvata lugens）两条Tret1的序列结构,进一步抑制NlTret1的表达,探讨这两个NlTret1在褐飞虱体内的生物学功能。【方法】以褐飞虱两条Tret1序列为研究对象,利用生物信息学技术分析其蛋白结构以及与其他昆虫之间的同源性。采用RNAi（RNA interference）技术将合成的外源dsRNA（double-stranded RNA）注射到实验室饲养褐飞虱种群体内,抑制其体内NlTret1的表达,分别在注射48 h后取材,抽取总RNA并用反转录试剂盒合成第一链cDNA,采用qRT-PCR（quantitative real-time PCR）技术检测dsNlTret1的干扰效果以及RNAi后褐飞虱体内海藻糖代谢通路中相关基因的表达,最后测定葡萄糖、海藻糖和糖原含量以及海藻糖酶活性。【结果】生物信息学分析表明,NlTret1-like X1和NlTret1-2 X1的开放阅读框长度分别为1 920和1 578 bp,分别编码639和525个氨基酸,预测蛋白分子量分别为69.29和58.71 kD,等电点分别为8.32和8.36;NlTret1-like X1和NlTret1-2 X1的二级结构主要包含螺旋和卷曲;保守结构域分析显示它们均属于MFS家族。进化分析结果显示,不同昆虫的Tret1蛋白具有较高的同源性,且褐飞虱与其他半翅目昆虫具有较近的亲缘关系;与注射dsGFP组相比,注射靶标基因的dsRNA后均能够显著沉默本基因的表达;褐飞虱体内糖原、葡萄糖在注射dsNlTret1-like X1和dsNlTret1-2 X1后,其含量均无显著变化,然而不同于注射dsNlTret1-2 X1组,在注射dsNlTret1-like X1后褐飞虱体内海藻糖含量极显著升高;干扰NlTret1-like X1 48 h后褐飞虱体内TPS1、TPS2、TRE1-1、TRE1-2和TRE2的表达均极显著下调;而干扰NlTret1-2 X1 48 h后褐飞虱体内TPS1、TPS2和TRE1-1的表达虽也极显著下降,但TRE1-2和TRE2极显著上调;在注射dsNlTret1-like X1后,试虫可溶性海藻糖酶和膜结合型海藻糖酶的活性均极显著降低,而在注射dsNlTret1-2 X1后无显著变化。【结论】褐飞虱的两个Tret1在不同组织间发挥着不同的功能,其中NlTret1-like X1在特异性转运海藻糖参与能量供应中起到更为显著的作用。研究结果有助于探索Tret1在昆虫或无脊椎动物中调控海藻糖代谢平衡的调节机制,可为将来通过调控血糖平衡来控制褐飞虱等害虫提供理论依据。     

乳糖诱导海藻糖合成酶基因工程菌条件优化

研究乳糖代替异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导海藻糖合成酶(Tres)在基因工程菌p ET-30a(+)Tres/BL21中的表达,分别对用乳糖作为诱导剂时的诱导时机、乳糖浓度、诱导持续时间和添加方式,确定了乳糖诱导的最佳条件。经过试验验证,工程菌对数生长中期,OD600 nm约为0.8时,分批次添加终浓度为0.5 mmol/L的乳糖于25℃条件下,诱导5 h,乳糖诱导的蛋白表达量达到最高值。通过试验证明,乳糖可以作为一种很好的诱导剂代替IPTG诱导p ET-30a(+)Tres/BL21中重组产物海藻糖合成酶,为今后海藻糖合成酶生产开发利用提供试验基础。     

Prd29A启动子在小麦中的诱导表达活性及大肠杆菌海藻糖合成酶基因的转化

以gus基因为报告基因，通过瞬时表达测定了Prd29A诱导型启动子在小麦愈伤组织中的诱导表达活性。结果表明，Prd29A-gus基因的表达水平可在不同浓度NaCl盐的胁迫条件下得到显著提高。由此证实，Prd29A启动子在小麦中具有较强的诱导表达活性。在此基础上，将Prd29A诱导型启动子驱动下的大肠杆菌海藻糖合成酶基因（otsA）采用花粉管途径导入目的小麦品系，经PCR筛选、Southern鉴定及转化后代海藻糖含量的测定，获得了一批otsA转基因植株及株系，为进一步选育耐盐抗旱的转基因小麦新品系奠定了基础．     

碱茅6-磷酸海藻糖合成酶基因的克隆及其耐逆性分析

从碱茅酵母cDNA文库中经过NaCl、NaHCO₃筛选,均得到长为1153 bp碱茅6-磷酸海藻糖合成酶基因(PutTPS)片段。通过3'End cDNA amplification方法获得基因缺失的3'序列,该基因全长3358 bp,编码882个氨基酸。氨基酸序列比较结果表明,PutTPS氨基酸序列与水稻、拟南芥、玉米等多种高等植物的TPS蛋白的同源性高达60%90%。利用Northern blot技术,研究该基因的组织表达模式及NaCl、NaHCO₃胁迫处理下基因的表达模式变化;同时对转pYES₂- PutTPS基因酵母菌株进行盐、碱、氧化胁迫、渗透胁迫处理,观察其在逆境下的生存表现。结果表明,PutTPS具有组织表达特异性,其中在根和花中表达量最大;NaCl、NaHCO₃会诱导PutTPS 基因在根和叶中的上调表达;同时重组酵母菌株对盐碱、氧化、渗透胁迫及干旱等逆境的适应能力显著增强。以上研究结果表明,碱茅PutTPS基因与逆境之间具有一定的应答关系,并在植物适应环境逆境过程中起着重要的作用。     

高压脉冲电场对中性海藻糖分解酶活性的影响

以啤酒废酵母细胞为原料,以海藻糖和葡萄糖的含量为衡量指标,当啤酒酵母细胞悬浮液料液比(g/mL)为1∶30、电场强度为40 kV/cm、脉冲数为6时,对比分析了pH值为7环境下的啤酒酵母细胞中海藻糖分解酶活性的变化情况。结果表明:经高压脉冲电场处理后的啤酒酵母细胞中海藻糖含量相对较高,可以说明高压脉冲电场对pH值为7环境下的啤酒酵母细胞中海藻糖分解酶活性具有一定的抑制作用。     

HPLC检测啤酒废酵母细胞中3种糖含量的方法研究

以海藻糖、葡萄糖、半乳糖3种标准品和啤酒酵母细胞为试验原料,利用高效液相色谱分析方法,分别构建了海藻糖、葡萄糖、半乳糖3种糖HPLC检测方法。研究表明:海藻糖、葡萄糖、半乳糖的保留时间依次为7.6、9.5、10.4min,标准曲线的回归方程依次为:Y海藻糖=160 421 X+202.29(R2=0.999 7),Y葡萄糖=166 165 X(R2=0.998 4),Y半乳糖=172 092 X+1 062.2(R2=0.999);利用该方法分析啤酒酵母细胞中海藻糖含量较高,同时发现啤酒酵母细胞破壁样品中存在其他2种未知糖类。     

小球藻的风干致死及干燥保护研究

[目的]研究小球藻的风干致死及干燥保护方法。[方法]比较7种保护剂对处于对数生长期的小球藻细胞的保护作用。[结果]海藻糖对藻细胞的保护效果最好,当海藻糖用量为5%时,藻细胞存活率提高了50%。[结论]该研究结果对淡水微藻的诱变育种具有重要指导意义。     

谷氨酸棒杆菌麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的克隆与表达

采用PCR方法从谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）基因组中分离得到2.4 kb的麦芽寡糖基     

外源海藻糖对NaCl胁迫下番茄幼苗生理指标的影响

在0.4%NaCl胁迫下,利用0.3%~0.5%的外源海藻糖处理番茄幼苗,研究其对番茄幼苗生长及叶片保护酶活性和氧化损伤的影响。结果表明:0.5%的外源海藻糖处理显著提高了番茄幼苗的株高、茎粗、根系活力、叶片叶绿素含量和SOD酶的活性,显著降低了MDA的含量,缓解NaCl胁迫伤害的效果最好,增强了植株的耐盐性。