建兰花叶病毒检测标准方法的建立

经过2004￣2005两年对上海口岸进境和进境后种植的260个兰花品种上建兰花叶病毒(CyMV)检测方法的研究,分别建立了检测和鉴定兰花上建兰花叶病毒的DAS-ELISA、电镜观察、鉴别寄主反应、RT-PCR和IC-RT-PCR的方法。     

番茄黑环病毒分子生物学检测方法及分离物序列分析

根据TBRV运动蛋白基因的保守序列设计引物，RT-PCR和IC-RT-PCR能从6个TBRV的分离物中分别扩增到与预期大小相同的DNA条带，序列测定和分析表明所测定的序列为TBRV运动蛋白基因的部分序列，在系统关系树上与TBRV的其它分离物形成一簇，表明所建立的RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法是可靠的。     

检测砂梨潜隐病毒的IC-RT-PCR和TC-RT-PCR的研究

以砂梨为试材,在生物学和血清学检测的基础上,采用免疫捕作RT-PCR穴IC-RT-PCR雪和试管捕作RT-PCR穴TC-RT-PCR雪技术,对苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)和苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus,ASGV)进行了检测分析。结果表明,TC/IC-RT-PCR均能有效检测梨粗提液中的ACLSV和ASGV,分别获得了大小约358bp和499bp的目标扩增片段;但IC-RT-PCR检测ACLSV的效果受到病毒分离株间血清学关系影响。与传统的RT-PCR相比,IC/TC-RT-PCR不仅灵敏度更高,而且不需提取总RNA,可以简化操作程序和减少苯酚、氯仿类有机试剂对人体的伤害和对环境的污染,适合于大量梨样品的病毒快速灵敏检测。     

TaqMan-MGB荧光定量IC/TC-RT-PCR检测菜豆荚斑驳病毒

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国重要的检疫性有害生物,BPMV传入的风险随大豆进境数量增多而加大。本文针对菜豆荚斑驳病毒,以大豆种子提取液为材料,分别建立了TaqMan-MGB荧光定量IC-RTPCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR快速检测方法。根据GenBank公布的BPMV外壳蛋白基因序列,选择其保守区域,设计1对特异性引物和1条TaqMan-MGB探针,测定了TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR方法的特异性和灵敏度,并将TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR、TaqMan-MGB荧光定量TC-RTPCR、IC-RT-PCR和TC-RT-PCR 4种检测方法的灵敏度进行比较。结果表明:所建立的两种检测方法特异性良好;TCRT-PCR的灵敏度为10-1倍病毒提取液原液;IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR灵敏度相当,为10-3倍病毒提取液原液;TaqMan-MGB荧光定量IC-RT-PCR灵敏度最高,为10-5倍病毒提取液原液,是IC-RT-PCR和TaqMan-MGB荧光定量TC-RT-PCR检测方法的102倍,是TC-RT-PCR检测方法的104倍;两种检测方法均能较好应用于实际大豆样品的检测。本文所建立的TaqMan-MGB荧光定量IC/TC-RT-PCR检测方法利用抗原特异性或试管非特异性捕捉病毒粒子,无需提取RNA,为进境大豆种子上BPMV的检测提供了稳定、快速、简便的技术依据,其较高的灵敏度和特异性具有较好的应用价值。     

齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒分子检测研究

齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）与建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus, CyMV）是严重危害兰科植物的两种主要病毒。本研究根据病毒外壳蛋白基因设计特异性引物,应用ELISA、普通RT-PCR、巢式RT-PCR和免疫捕获RT-PCR4种方法进行了检测研究与比较。结果表明：普通RT-PCR与ELISA方法检测灵敏度相当;巢式RT-PCR检测灵敏度要比普通RT-PCR与ELISA方法高出104倍以上;免疫捕获RT-PCR检测灵敏度介于普通RT-PCR和巢式RT-PCR之间。采用巢式RT-PCR方法对我国台湾进境的蝴蝶兰植株样本检测,1号样本出现与阳性对照一致的特异条带。双向测序分析,扩增产物序列与ORSV外壳蛋白基因具有100％的同源性,表明1号蝴蝶兰样本携带ORSV。     

基于一步法RT-PCR的瓜类单粒种子携带CGMMV的快速检测技术

为探究直接检测瓜类单粒种子携带黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)的快速检测技术,以一步法RT-PCR为基础,构建同时扩增CGMMV基因组3′端和5′端基因的(一步法)双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR和巢式双重IC-RT-PCR技术,灵敏度分别为10-3、10-3、10-4,巢式双重IC-RT-PCR灵敏度比双重RT-PCR、双重IC-RTPCR高10倍。对不同种质、不同来源的种子及种子的不同部位进行检出率比较,巢式双重IC-RT-PCR检出率高于其它2个检测技术,试验种子种表带毒检出率高于种子组织研磨物,商用种子种表带毒检出率低于种子组织研磨物。为有效阻断毒源,建议同时对种表和种子组织研磨物进行检测,种表采用双重RT-PCR检测,种子组织研磨物采用双重IC-RT-PCR或巢式双重IC-RT-PCR检测。     

应用IC-RT-PCR方法检测水仙中百合斑驳病毒

水仙病毒严重影响水仙的品质与规模化生产,而快速检测水仙病毒可以有效防控其危害与扩散。根据已报道的百合斑驳病毒外壳蛋白基因序列设计PCR引物,利用免疫捕获PCR检测了水仙样品中百合斑驳病毒。PCR扩增产物回收后克隆到PMD19-T载体中测序。把克隆得到的百合斑驳病毒外壳蛋白基因部分序列提交到Genbank中。结果表明:基因登录号为JF714974,克隆的百合斑驳病毒外壳蛋白基因部分序列与国内外百合斑驳病毒同源性为90.4%~99.5%。建立了水仙中百合斑驳病毒的IC-RT-PCR的检测方法,简化了试验步骤,适合于水仙中百合斑驳病毒的快速检测。     

从进境印度尼西亚辣椒种子中截获番茄环斑病毒

本文利用DAS-ELISA方法从印度尼西亚进境的辣椒种子中初步筛选出疑似感染有番茄环斑病毒(ToRSV)的样品,利用IC-RT-PCR(immune capture RT-PCR)扩增特异性片段,进而对扩增的PCR产物进行了测序和序列比对,确认我们在进境的辣椒种子中检出了我国关注的检疫性有害生物——番茄环斑病毒。此前该病毒未有在印度尼西亚辣椒上危害的报道,是系统内首次在蔬菜种子上截获该病毒。     

DAS-ELISA、RT-PCR和IC-RT-PCR检测葡萄卷叶病毒Ⅲ的比较研究

在生长季节分3次对部分葡萄品种枝条上部、中部和下部叶片及韧皮部,进行双抗体夹心法(DAS-ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)3种方法检测卷叶病毒Ⅲ(GLRaV-3)的比较。结果表明:DAS-ELISA的检出率明显低于RT-PCR和IC-RT-PCR方法。RT-PCR可以检测出RNA提取液为1:10-4的GLRaV-3病毒,但它受到了提取RNA难以及其它物质(如蛋白质、DNA等)干扰的影响,检测难度增加。从检测的灵敏度来看,RT-PCR和IC-RT-PCR比DAS-ELISA灵敏;并且,IC-RT-PCR比其它两种方法较快,整个过程仅需8h。