GICA-RT-PCR检测菜豆荚斑驳病毒的新方法

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)是我国进境植物检疫性有害生物.为解决普通RT-PCR不能直接检测大豆病种子中该病毒的问题,将简便快速的胶体金免疫层析技术(GICA)和高灵敏度的普通RT-PCR检测技术有机地结合起来,建立了GICA-RT-PCR检测新方法.即先用GICA捕获病毒,将捕获的病毒直接进行RT-PER扩增,简化了检测的步骤,提高了检测的灵敏度.结果表明:用该方法检测提纯病毒灵敏度达到0.01μg·mL-1、检测大豆病叶和病大豆种皮,灵敏度达到10-4,分别比GICA检测提高了20倍、10倍和100倍.GICA-RT-PCR可进一步确认GICA的结果.     

菜豆荚斑驳病毒的RT-PCR检测

菜豆荚斑驳病毒是对大豆经济具有重要影响的病毒.根据已报道的菜豆荚斑驳病毒外壳蛋白基因序列,设计出一对特异性引物,采用RT-PCR法,可有效地扩增出BPMV不同亚组的4个分离物,得到650 bp大小的PCR产物.这种方法能成功地检测出大豆病叶中的BPMV,结果和酶联检测是一致的,而对大豆种皮中BPMV的检测效果不佳,建议采用酶联的方法进行检测.     

基于一步法RT-PCR的瓜类单粒种子携带CGMMV的快速检测技术

为探究直接检测瓜类单粒种子携带黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)的快速检测技术,以一步法RT-PCR为基础,构建同时扩增CGMMV基因组3′端和5′端基因的(一步法)双重RT-PCR、双重IC-RT-PCR和巢式双重IC-RT-PCR技术,灵敏度分别为10-3、10-3、10-4,巢式双重IC-RT-PCR灵敏度比双重RT-PCR、双重IC-RTPCR高10倍。对不同种质、不同来源的种子及种子的不同部位进行检出率比较,巢式双重IC-RT-PCR检出率高于其它2个检测技术,试验种子种表带毒检出率高于种子组织研磨物,商用种子种表带毒检出率低于种子组织研磨物。为有效阻断毒源,建议同时对种表和种子组织研磨物进行检测,种表采用双重RT-PCR检测,种子组织研磨物采用双重IC-RT-PCR或巢式双重IC-RT-PCR检测。     

水稻细菌性谷枯病菌的实时荧光PCR检测技术研究

 水稻细菌性谷枯病菌Burkholderia glumae于2007年被列为我国进境植物检疫性有害生物,国内急需建立针对该菌切实可行的检测技术, 以有效控制它在我国的传播。采用实时荧光PCR（real time fluorescence PCR）和经典PCR技术进行水稻细菌性谷枯病菌检测。研究结果表明,供试所有谷枯病菌都能产生139 bp左右的特异性片段,非谷枯菌株均无特异性片段产生。两种检测方法的灵敏度比较发现,常规PCR技术在病菌浓度为104CFU/mL时即可检测到,实时荧光PCR技术在病菌浓度为102CFU/mL时即可检测到,后者比前者的灵敏度高100倍。将模拟带菌种子与灭菌种子按1∶100混合,实时荧光PCR技术可以检测到该菌的存在。     

转基因大豆中外源基因g10evo-epsps 的qPCR检测方法的建立和验证

耐除草剂基因g10evo-epsps 在我国转基因农作物研发中常常被用作目标性状基因或筛选标记基因，因此 可作为转基因成分检测的重要筛查基因，但目前缺少相应的检测方法。本研究旨在建立g10evo-epsps 基因特异性 的实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法，从而为转基因大豆的监测提供一种稳定可靠的方法体系。本研究基于转基 因大豆中的g10evo-epsps 基因序列设计了qPCR检测引物和探针，并对检测方法的特异性、灵敏度、准确度和精确性 进行了实验室内验证。结果显示，建立的g10evo-epspsqPCR检测方法能够特异性检测转基因大豆ZUTS-33中的 g10evo-epsps 目的基因；标准曲线分析表明，3次重复试验的扩增效率在90%以上，R2 均大于0.99；方法的检测限 （LOD）为不高于8拷贝，定量限（LOQ）推测为16拷贝；对含量为4.5%、2%、0.5%、0.09% 和0.045% 的转基因大豆 ZUTS-33基因组DNA进行准确度分析，发现该方法测定的平均值和预期值之间的偏差为0.00%~11.11%，3次重复 试验的RSDr为2.30%~17.10%。结果表明本研究建立的g10evo-epsps qPCR检测方法能够满足转基因大豆筛查检测 的要求，为转基因大豆监管和标识提供技术支撑。     

菜豆荚斑驳病毒RT-PCR扩增产物胶体金层析检测方法的建立

菜豆荚斑驳病毒是我国进境植物检疫性有害生物,为了能在现场快速检测出该病毒,将PCR核酸扩增的高灵敏度和胶体金层析方法快速简便、直观的优点结合起来,建立了PCR扩增产物的胶体金层析检测方法.该方法是用生物素标记上一个引物,用荧光素(或地高辛)标记上另一个引物,通过PCR扩增产生双标记的扩增产物.将兔抗生物素多克隆抗体与20～30 nm大小的胶体金颗粒结合上并固定在释放垫上,同时在硝酸纤维素层析膜上点上抗荧光素(或地高辛)的单克隆抗体作为T检测点,点上羊抗兔多克隆抗体作为C质控点.这种RT-PCR扩增产物可在T点上被检测到,同时C点也要显色.用所建立方法在15 min内可检测出菜豆荚斑驳病毒的RT-PCR扩增产物,免去了溴化乙锭染色和电泳的过程.     

槟榔隐症病毒1型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、精准且能定量分析槟榔隐症病毒1型（Areca palm velarivirus 1, APV1）的检测方法。本研究参照GenBank中已登录的APV1全基因组序列,在p21蛋白基因保守区域和p60蛋白基因保守区域之间设计1对特异性RT-PCR引物,并构建阳性重组质粒;在p60蛋白基因保守区域部分设计荧光定量PCR特异性引物和TaqMan-MGB探针,利用阳性重组质粒,构建标准曲线,并对该检测方法的敏感性、特异性、稳定性及其应用效果进行验证。结果显示：该方法对阳性质粒标准品检测的敏感性达3.0×10¹ copies/μL级别,是常规RT-PCR敏感性的100倍;标准曲线显示,C_t值与拷贝数的对数呈线性关系,其标准曲线方程为y=-3.2748x+42.957,扩增效率为102%,相关系数R²为0.9992;该方法对APV1的检测具有较好的特异性,其他槟榔病原物及内生菌不会对本方法产生非特异性干扰;批内与批间重复性试验结果显示,该方法对APV1的检测具有较好的重复性和稳定性;利用该方法对海南万宁、琼海、定安、文昌等4个市（县）采集的181份疑似样品进行检测,阳性率分别为91.95%、86.95%、89.65%、73.68%,其阳性的病毒拷贝数最高达1.59×10⁷copies/μL,表明海南部分地区APV1病毒载量较高、流行情况比较严重。     

建兰花叶病毒RT-LAMP检测方法的建立

建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus,CyMV）是侵染兰花的主要病毒,严重影响其观赏价值,建立快速、灵敏的检测方法显得尤为重要。根据CyMV的外壳蛋白基因序列设计4对特异性引物,经过优化反应条件,建立该病毒的RT-LAMP 检测方法,并进行LAMP检测的特异性、敏感性检测。该方法能特异扩增CyMV,与其他4种病毒（齿兰环斑病毒、菜豆黄花叶病毒、黄瓜花叶病毒和小苍兰花叶病毒）不发生反应;灵敏度为RT-PCR的10倍。田间检测20份样品中,RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致,检出率为60%。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ,直接用肉眼观察就可判断样品是否感染CyMV,可省去电泳分析的时间。针对CyMV建立的RT-LAMP方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点,适用于在进境检疫及种苗繁育过程中的检测鉴定。     

食品过敏原大豆P34蛋白基因的实时荧光PCR检测

以大豆主要过敏蛋白P34基因为靶标,采用TaqMan探针实时荧光PCR方法建立食品过敏原大豆成分的检测方法。实验表明建立的检测方法具有特异性,灵敏度高,检测限为10mg/kg。通过对市售样品的检测,该方法适用于对常见食品种类的检测,但不适用于精加工油脂等精细加工产品的检测。     

食品过敏原大豆P34蛋白的实时荧光PCR检测（简报）

本文以大豆主要过敏蛋白P34基因为靶标,采用TaqMan探针实时荧光PCR方法建立食品过敏原大豆成分的检测方法。实验表明建立的检测方法具有特异性,灵敏度高,检测限为10mg/kg。通过对市售样品的检测,该方法适用于对常见食品种类的检测,但不适用于精加工油脂等精细加工产品的检测。     

实时定量荧光PCR法检测马铃薯黑胫病菌

马铃薯黑胫病是国内外马铃薯产区发生比较普遍的一种细菌性病害,严重地影响了马铃薯的产量和质量。本研究根据Potato Black Leg序列,设计出马铃薯黑胫病菌特异性的引物,对10种供试菌株进行了实时荧光PCR检测。结果表明,该方法的特异性好,可以将马铃薯黑胫病菌和其它马铃薯常见病害相区分;灵敏度较高,可检测出最低的黑胫病菌浓度为3.6~3.9 cfu.mL-1;而且检测时间仅用4 h,大大缩短了检测周期。该方法可有效地应用于马铃薯黑胫病菌的检测和监控。     

植物激素测定方法述评

分析了传统植物激素测定的方法,提出了新的技术发展下,对植物激素快速、原位实时、高灵敏、高通量检测的必要性,对植物激素测定方法的前沿技术做出分析,并初步探讨了植物激素测定技术的未来趋势。     

茶树新梢不同叶片中β-葡萄糖苷酶和β-樱草糖苷酶基因表达的实时定量PCR分析

在建立茶树基因表达绝对定量实时PCR检测方法后,检测了龙井43新梢不同部位叶片中的β-葡萄糖苷酶和β-樱草糖苷酶基因的表达情况,结果表明β-葡萄糖苷酶在一芽五叶新梢的第四叶中表达活性最高,为2.86E+08拷贝/μl,第四叶>第三叶>第五叶>第二叶>一芽一叶;而β-樱草糖苷酶基因在一芽一叶中最高,为4.31E+06拷贝/μl,一芽一叶>第二叶>第三叶>第四叶>第五叶。与茶叶香气密切相关两个基因在茶树不同部位的叶片中表达量和表达类型存在明显差异。本实验建立的实时荧光定量PCR可有效地用于茶树基因表达的定量分析。     

不同O/L值花生品种油酸脱氢酶基因的时空表达特征

本研究以不同油酸/亚油酸比值（O/L比）花生品种为材料,利用实时荧光定量PCR技术,对四个不同O/L花生品种不同组织中油酸脱氢酶基因（FAD2）的表达进行相对定量分析。结果表明：FAD2基因在不同O/L基因型中组成型表达,其在根、茎、叶中表达量低,在花中表达量最高,显著高于荚果等其它组织中的表达量,且品种间差异达显著水平;花U606和花U12在花、幼荚、成熟荚果中的表达量呈依次下降趋势;花育17和狮油红4号在花、幼荚、成熟荚果中的表达量则呈现高-低-次高的表达趋势,差异达显著水平。       

应用多重荧光PCR快速筛查作物中转基因成分研究

通过对我国批准进口的和获得农业转基因生物安全证书的转基因玉米转化体的序列分析发现,除DAS40278-9和BLVA430101外,CaMV35s启动子、NOS终止子、Cry1Ab/Ac基因和pat基因覆盖了21种玉米转基因转化体。通过引物组合筛选、反应体系优化、灵敏度测试、适用性测试等实验,建立了基于4个通用筛选元件及zSSIIb内源基因的五重荧光PCR和基于转化体特异性序列的二重荧光PCR检测转基因成分方法体系。方法参数测定结果表明,此方法特异性强、稳定性好,检测灵敏度达到0.05%。同时,此方法体系不仅适用于转基因玉米成分筛查,对大豆、水稻等多种作物进行转基因成分筛选鉴定也有良好的适用性。     

柑橘溃疡病菌LAMP实时浊度检测方法的建立及应用

以柑橘溃疡病菌特异性高的假定蛋白基因（登录号：AE008923.1）为靶标，设计并筛选4条引物来特异性识别靶标序列中的6个独立区域，建立柑橘溃疡病菌LAMP实时浊度检测方法。该方法利用实时浊度仪检测反应过程中产生的焦磷酸镁白色沉淀，实现对LAMP整个反应过程的实时监控。从镁离子浓度、甜菜碱浓度、dNTPs浓度、引物浓度和反应温度5个变量参数对 LAMP检测体系进行优化，并对方法的特异性、灵敏度、稳定性及实际样品检测效果进行评价。结果显示，该体系经优化后稳定性良好，可在66 ℃ 恒温条件下，60 min内完成检测；DNA检测下限可达0.02 ng/μL，灵敏度与荧光定量PCR方法相同，比常规PCR方法高1个数量级；能快速、准确地对田间疑似样品进行检测，与荧光定量PCR方法的检出情况一致，没有漏检。结果说明柑橘溃疡病菌实时浊度LAMP检测方法操作简便、所需时间短，特异性与灵敏度高，为柑橘溃疡病菌的快速筛查提供较好的途径。     

实时荧光定量PCR筛选稻曲病菌内参基因

 通过实时定量PCR分析了稻曲病菌中5个传统内参基因18S rRNA、GAPDH、ubiquitin、β actin、α tubulin的mRNA差异表达情况,并利用geNorm软件分析了它们在4个发育时期和NaCl胁迫处理中的表达稳定性。结果表明,在菌龄为7 d、8 d、9 d、10 d的稻曲病菌中,α tubulin 2和β actin表达稳定;在0.4 mol/L  NaCl溶液处理0 h、4 h、8 h、12 h、16 h后,β actin和α tubulin 2表达稳定。因此,当利用荧光定量PCR分析比较稻曲病菌基因表达差异时,可选择α tubulin和β actin作为内参基因。     

A specific qualitative and real-time PCR detection of MON863 maize based on the 5′-transgene integration sequence

Genetically modified crops are widely grown in the world today. Labeling is required when genetically modified organisms (GMOs) are placed on the market. There is a need to establish a specific method for the detection of genetically modified foods. MON863 transgenic maize containing a Cry3Bb1 sequence that produces insecticidal protein cry3Bb1 is a major GMO crop. In this paper, we report studies that designed specific PCR primers and TaqMan probes based upon the 5′-transgene integration sequence, and developed qualitative and quantitative PCR conditions using these primers and probes. We determined the 5′-transgene integration sequence using a ligation-mediated polymerase chain reaction (LM PCR) method. In qualitative PCR studies, the limit of detection (LOD) was 0.5% for MON863 in 100 ng genomic DNA. In the quantitative PCR assays, the limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) are 10 and 100 haploid copies, respectively. Maize samples with different contents of genetically modified component were tested using the established TaqMan real-time PCR system.     

甘蔗水分胁迫响应的δ-鸟氨酸转氨酶基因克隆及分子特征分析

通过消减文库技术,结合cDNA芯片技术筛选到1个明显受水分胁迫诱导的EST序列（Ratio值为8.1）,比对分析推测其为δ-OAT基因的片段,进而通过RACE结合PCR技术获得该基因全长cDNA序列为1782bp,其中5′端非编码区150bp,开放阅读框为1362bp,3′端非编码区为270bp且存在2个终止加A信号AATAA。预测其编码的蛋白质分子量为49.5ku,等电点为6.5,为一个跨膜蛋白。序列比对分析结果表明,δ-OAT基因家族N末端和C末端相对不保守,而主要功能区均表现保守。基因进化分析显示,单子叶禾本科植物和双子叶植物鸟氨酸转氨酶编码基因分别由各自祖先进化而来,而微生物的鸟氨酸转氨酶编码基因表现出复杂的进化关系。荧光实时PCR分析δ-OAT在根、茎、叶的表达,该基因在茎的表达较高,其次是叶而后为根,但没有明显的组织表达特异性。本文首次报道甘蔗δ-OAT基因克隆研究结果,为该基因的深入研究和应用奠定一定基础。     

基于单分子实时测序的油莎豆全长转录组分析

油莎豆以其适应性广、产量和含油量高而成为我国的新型油料作物。为解析油莎豆的遗传基础，服务于 育种和分子生物学研究，采用单分子实时测序技术构建了油莎豆高质量的全长转录组，混合样本的组织来源包括 块茎、匍匐茎、根、芽、叶片、叶鞘、花、花茎等。研究基于23.20 Gb高质量的原始数据提取获得环形一致序列319 568 条，其平均长度和测序深度分别为2101 bp和43×；通过聚类、校正和去冗余最终得到高质量的序列57 849条，合计 121.79 Mb；转录组的完整性约为79.58%，其中约有76.20%的为全长转录本；通过比对NR、Swissprot、GO、KOG、egg⁃ NOG、Pfam、KEGG等数据库，共获得52 424条序列的注释信息，注释比例约为90.62%；此外，研究还预测获得3759 条lncRNA、43 060个SSR位点以及2300条转录因子序列。这些结果不仅增加了我们对油莎豆遗传特性的认知，同 时还为下一步开展基因表达谱分析、功能基因的挖掘与利用等奠定了坚实的基础。