棉花角斑病菌V8高效电转化条件的探索

对去甲基化氮胞苷(5-AZA)的最佳浓度以及影响棉花角斑病菌[Xanthmonas campestris pv.malvacearum(Xcm)]V8电转化效率的诸多因素进行逐一研究,以期获得高效的电转化条件。结果表明,选取100μmol/L的5-AZA驯化处于对数中期的V8制备感受态细胞;保证电压2.1 kV、50μg/mL质粒7μL、4℃预冷复苏培养基SOC、振荡复苏培养4～5 h时,V8的电转化效率高达5×102/μg DNA。     

Bt cry I A（c） 杀虫基因向棉内生细菌Bacillus cereus染色体中整合的研究

将来自Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki的Bt CRy I A(c) 杀虫基因通过综合质粒载体pBC601，整合到棉花（Gossypium hirsutum)优势内生细菌Bacillus cereus(Bc9002)的染色体上，得到的工程菌对棉铃虫（Helicoverpa armigera Hb.)有杀虫活性。此综合质粒含有能在营养期表达Bt cry I A(c) 基因的强启动子，cry I A(c)杀虫基因，四环素抗性标记基因tet^r 8.0kb的EcoR I-Nco I B.cereus染色体片段。将综合质粒通过电击导入B.cereus(Bc9002)中，综合质粒因含B.cereus染色体片段，可与B.cereus染色体发生同源重组，从而将Bt cry I A(c)基因整合到B.cereus的染色体上。通过对转化子的DNA酶切分析，PCR扩增，SDS－PAGE凝胶电泳检测，ELISA检测，电镜观察，毒力测定。结果表明Bt cry I A(c)基因已经整合到内生细胞Bc9002的染色体上，并可高效表达。     

地衣芽胞杆菌HS10原生质电转化体系的研究

地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis HS10及其粗蛋白对多种病原真菌具有防治效果,为挖掘其生防功能基因,本研究通过对原生质体的制备、再生培养基、渗透压稳定剂、电击参数等试验条件进行优化,建立了地衣芽胞杆菌HS10原生质体电转化法。结果表明最佳转化条件为:转接培养10h达到对数生长后期的菌体,浓缩4倍后,利用终浓度1mg/mL的溶菌酶,于37℃、150r/min酶解20min,酶解效率达到99.34%,1×SMM洗涤3次,调整菌浓度至1.0×108 cfu/mL,并通过1.6kV、5ms的电击后,迅速在SMMP溶液中100r/min、37℃恢复6~10h,涂布于含Kan和Erm的再生培养基DM3平板。将该方法用于突变体库构建的质粒pMarA(8 253bp)和基因敲除质粒pMADΔCP(13 043bp)的大片段质粒转化,分别获得了37cfu/μg DNA和10cfu/μg DNA阳性转化子。该遗传转化体系为地衣芽胞杆菌HS10中相关基因功能的研究提供了技术支撑。     

6株羊源乳酸杆菌电转化条件的优化

选取质粒pLEM415-egfp电转化源于陕北白绒山羊瘤胃的乳酸杆菌,研究不同生长时期及电场强度对6株羊源乳酸杆菌电转化效率的影响,并优化其转化条件。在37 ℃培养条件下,培养6株羊源乳酸杆菌,当D_{600 nm} 达到0.4、0.6、0.8、1.0和1.2时,离心收集菌体,制备感受态细胞;在电阻200 Ω、电容25 uF条件下,分别采用1.5、2.0和2.5 kV 3种电场强度电击转化感受态细胞。结果表明,羊源植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)、罗伊乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、棒状乳酸杆菌(Lactobacillus coryniformis)和弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus curvatus)获得最高转化效率的D_{600 nm}和电场强度分别为0.8、1.2、1.0、0.6、0.8、0.4和1.5、1.5、1.5、1.5、1.5、2.0 kV。羊源乳酸杆菌最佳转化条件的确立,为后续乳酸杆菌转基因工程菌的构建及其应用奠定了基础。     

乳酸菌电转化的原理与转化条件的优化

乳酸菌作为人和动物体内的正常菌群,具有诸多益生功能,因此被广泛应用于轻工、食品、医药及饲料工业等许多行业上。乳酸菌的遗传转化是限制对其遗传操作的关键因素之一,本文结合电转化原理,综述了乳酸菌电转化条件的优化指标。     

提高黄色短杆菌C-11电转化效率的方法

黄色短杆菌C-11是L-丝氨酸工业化生产的优良菌株,而基因工程菌的构建是提高L-丝氨酸产量的有效途径.在基因工程菌株的构建过程中,重组质粒的转化效率是获得重组菌株的关键.电转化是近几年来被广泛应用的一种快捷而高效的转化方法.电转化效率的高低取决于菌株的特性、质粒的大小、转化的电压、温度、溶液体系、菌体与DNA的浓度等诸多因素,从几个方面就黄色短杆菌C-11电转化效率的提高方法加以论述,也为其它黄色短杆菌电转化效率的提高提供参考方法.     

重组基因工程乳酸菌的研究进展

乳酸菌作为人和动物体内的正常菌群,具有诸多益生功能.随着分子生物学研究的不断深入,重组基因工程乳酸菌研究取得了较快进展.在构建表达外源功能性基因的重组基因工程乳酸菌、表达保护性抗原蛋白质用以递呈黏膜免疫抗原的过程中,乳酸菌质粒载体起到了至关重要的作用.电转化技术的应用,简化了操作过程,推动了重组基因工程乳酸菌的研究与应用.     

高效电转化技术在噬菌体抗体库构建中的应用

大肠杆菌的高效电转化技术是构建大容量噬菌体抗体库的关键技术，为了制备高转化效率的大肠杆菌TGI感受态细胞，采用电转化方法探索该菌在对数生长期的不同生长阶段、细胞浓度、噬菌粒DNA含量、电场强度对电转化效率的影响。实验结果表明，在菌株处于对数生长期的0D600值为0．5时，收集细胞制备感受态，感受态细胞浓度为4．0×10m细胞／mL，噬菌粒pCANTAB—ScFvAFBI浓度为100pg/μL，电场强度为20kV／cm，此时制备的大肠杆菌TGI感受态细胞的电转化效率可达2．13×10，cfu／μg DNA。研究结果表明，利用本实验确定的参数，可以制备出大肠杆菌TGI高效电转化感受态细胞，为大容量噬菌体抗体库的构建奠定了坚实的基础。     

ECM 830电穿孔仪在毕赤酵母电转化中的应用

用线性化质粒与酵母细胞混合后进行电转化,培养细胞,菌体计数,通过计算转化率探索ECM 830电转仪的转化条件,确定出毕赤酵母电转化最佳条件,低电压模式;电压300 V;脉冲长度15 ms;脉冲次数为1次;为ECM 830电转仪在酵母转化中的应用提供依据.     

顺反子序列bioⅠ-orf 2-orf 3在枯草芽孢杆菌染色体中的整合

将来源于枯草芽孢杆菌的顺反子序列bioⅠ-orf 2-orf 3克隆到含氯霉素基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pE 3中,并在顺反子序列上游插入一个强麦芽糖启动子Pglv,构建成枯草芽孢杆菌整合载体pLHX8,电转化枯草芽孢杆菌受体菌1A747.从5μg/ml的氯霉素抗性平板上挑取两株转化子,通过基因组PCR鉴定,确定顺反子序列已经整合到枯草芽孢杆菌染色体上.