培养液中添加物对牛卵母细胞体外成熟、受精和胚胎早期发育的影响

<正>1951年Chang和Austin首次发现哺乳动物精子获能现象,开创了哺乳动物体外受精(IVF)研究的新时代。自Brackett于1982年获得世界上第一头试管犊牛以来,IVF技术得到迅速发展。但牛胚胎体外化生产技术是一个复杂的过程,不仅受各种人为因素的影响,还受到培养液等环境条件的制约,使体外受精胚胎发育率较低。本文就培养液中添加不同物质研究其对牛卵母细胞体外成熟、受     

牛卵母细胞体外受精技术

牛卵母细胞体外受精技术是指卵母细胞在体外条件下与雄配子发生结合,完成受精,发育成胚胎,成完整个体的技术,是适应市场发展,提高国内自主育种水平的高科技手段.体外受精技术可以选择后代性别,加速育种进程,提高受精质量,在科学研究和良种选育中对牛体外受精技术都有很大的需求.因此,本文将从牛卵母细胞的获取、精子的体外获能、体外受精以及胚胎发育和移植四个方面对牛卵母细胞体外受精技术进行简单的介绍.     

泛素激活酶抑制剂对猪精子获能状态、膜重构及体外受精的影响

【目的】评估泛素激活酶（E1）对猪精子获能、膜重构和体外受精的影响。【方法】选取5头长白猪采集精液，以硫醇酯法评估泛素激活酶（ubiquitin activating enzyme，E1）抑制剂（TAK-243）对精子中泛素（ubiquitin，Ub）与E1结合的影响；将精子分为鲜精组（Fresh）、DMSO组（DMSO）、获能组（Capacitated）及2.4、4.8和7.2 nmol/L TAK-243组，鲜精组用2 mL PBS重悬精子沉淀；获能组用2 mL获能液重悬精子沉淀；DMSO组及2.4、4.8和7.2 nmol/L TAK-243组分别用2 mL含0.07% DMSO及2.4、4.8和7.2 nmol/L TAK-243的获能液重悬精子沉淀，使用微生物动（静）态图像检测系统检测精子的动力学参数；以Western blotting法检测精子的酪氨酸磷酸化水平；Zn²⁺荧光探针检测精子的Zn²⁺含量；花生凝集素染色检测精子的顶体膜重构；免疫荧光法检测顶体表面精子黏附蛋白（AQN-1、AWN）的表达；体外受精法检测TAK-243对精卵结合和卵裂率的影响。【结果】硫醇酯分析结果表明，TAK-243处理组精子未形成Ub-E1复合物，说明TAK-243抑制了E1对Ub的激活作用。与鲜精组相比，获能组精子的曲线速度（VCL）和平均鞭打频率显著升高（P<0.05）。3个浓度TAK-243组与获能组精子的各项动力学参数差异均不显著（P>0.05）。与获能组相比，3个浓度TAK-243组酪氨酸磷酸化水平均显著降低（P<0.05），且随着TAK-243浓度的增加，精子蛋白的酪氨酸磷酸化水平逐渐降低。后续试验使用7.2 nmol/L TAK-243进行精子中Zn²⁺水平和顶体膜重构的研究，其结果表明，与获能组相比，7.2 nmol/L TAK-243组Zn²⁺水平、顶体膜完整性及AQN-1和AWN蛋白的表达水平均显著增加（P<0.05），精子与卵母细胞的黏附率和卵裂率均显著降低（P<0.05）。【结论】7.2 nmol/L TAK-243显著降低了精子获能期间蛋白酪氨酸磷酸化水平、精卵结合率和卵裂率，显著增加了Zn²⁺含量、顶体膜完整率及顶体表面蛋白AWN和AQN-1的表达，说明泛素-蛋白酶体信号通路参与了精子的体外获能。     

表皮生长因子的作用机理及对体外受精的影响

表皮生长因子(EGF)是一种重要的多肽类生长因子,它对卵母细胞的体外成熟和早期胚胎的发育具有明显的促进作用。大量研究表明:EGF能够以旁分泌(Paracrine)或自分泌(Autocrine)的形式作用于胚胎组织中的EGFR,刺激内细胞团(ICM)和滋养外胚层的增殖,从而调节早期胚胎的发育。     

牛IVF性控切割胚胎和整胚的冷冻保存研究

本研究分3个实验对比了采用不同处理的常规冷冻和玻璃化冷冻保存358枚体外受精(IVF)性控切割囊胚和326枚整胚的保存效果。结果表明：(1)用于冷冻整胚的常规方法对冷冻性控切割胚胎同样有效；(2)利用含10％EG 10％FBS的DPBS冷冻牛IVF控切割胚胎或整胚的效果明显优于用含10％甘油 0.4%BSA或1．4mol／LEG 0．1％PVOH的DMPBS；(3)采用微玻管玻璃化冷冻保存牛IVF性控切割胚胎的效果显著优于常规冷冻法。     

利用改善液培养牛卵母细胞和早期胚胎的研究

在基础液 M199配制的培养液中,加入牛卵泡内的颗料细胞,置39℃、5%的 CO_2培养箱中培养72 h 后回收过滤液(简称改善液)。用这种不同浓度和保存时间的改善液,在体外成熟培养牛卵母细胞和胚胎时分别代替培养液和培养液加颗粒细胞制作的单层细胞培养体系。结果表明:(1)在基础液 M199中分别加入0%、25%、50%、75%、100%改善液和对照纽,其分裂率(78.7%～83.0%)组间均无差异(P>0.05);受精卵在体外培养至囊胚率,其中0%改善液组为30.4%,与对照组46.5%有显著差异(P<0.01);囊胚孵化率0%和25%改善液组分别为57.1%和57.9%,与对照组76.6%有显著差异(P<0.01)。(2)改善液保存时间为0 d,-4℃ 5～7 d,-20℃180 d 和对照组,分裂率(80.5%～86.3%)组间均无差异(P>0.05);受精卵在体外培养至囊胚率和囊胚孵化率,其中-20℃保存180 d 组分别为31.1%和54.5%,与对照组46.1%和72.0%有差异(P<0.05)。     

β－转换生长因子对牛体外受精卵体外发育的影响

本研究主要检测ＴＧＦ－β对牛早期胚胎体外发育和移植后的成活率的影响。在试验１和试验２，添加０．３～７．０ｎｇ／ｍＬ的ＴＧＦ－β至无论是复杂培养液还是各成分已知的简单培养液中，囊胚中内细胞团细胞都不同程度地增长，比对照组的囊胚多０．５～１．０倍；此外在含有３．０～５．０ｎｇ／ｍＬ的ＴＧＦ－β的培养液中的囊胚，其孵化率显著地高于对照组。在试验３中，添加３．０ｎｇ／ｍＬ的ＴＧＦ－β显著地促进与不同细胞共同培养的囊胚内细胞团的细胞增长，在颗粒细胞或输卵管细胞及其两者组合当中的单层细胞上的囊胚表现突出。在试验４中，用ＴＧＦ－β培养所获得的囊胚移植于受体母牛，约４５～９０ｄ将受体屠宰检查中发现，ＴＧＦ－β的囊胚成活率高于无ＴＧＦ－β的囊胚．试验结果表明，ＴＧＦ－β可促进体外发育的囊胚内细胞团的细胞增长以及提高囊胚移植后的成活率。     

胰岛素和葡萄糖对水牛体外受精早期胚胎发育的影响

探讨了不同浓度的胰岛素和葡萄糖对水牛体外受精早期胚胎体外发育的影响。结果表明,添加胰岛素浓度为5μg/mL时,水牛早期胚胎的囊胚发育率、囊胚细胞数及冷冻-解冻后胚胎的孵化率都显著高于对照组及其他浓度组(P<0.05);加入葡萄糖的浓度大于6 mm o l/L时显著影响水牛早期胚胎发育到囊胚及孵化囊胚的阶段(P<0.05);联合添加胰岛素和葡萄糖时能显著提高水牛早期胚胎的孵化囊胚率、总囊胚率和囊胚细胞数(P<0.05)。实验证实,浓度为5μg/mL胰岛素能促进水牛体外受精早期胚胎的发育;在TCM-199中单独添加葡萄糖是不必要的,联合添加葡萄糖和胰岛素能促进水牛体外受精早期胚胎的发育。     

卵丘细胞对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

本试验探讨了卵母细胞周围不同类型的卵丘细胞对牛卵母细胞体外成熟、受精及其随后的胚胎发育的影响。卵母细胞周围一般都含有多层卵丘细胞。按卵丘细胞的层数及形态将卵母细胞大致分为５类：（１）无卵丘细胞；（２）有２～３层卵丘细胞；（３）有４～５层卵丘细胞；（４）有６层以上卵丘细胞；（５）异常者（即卵母细胞外周有较厚的透明胶状物而无正常卵丘细胞）。以上５种卵母细胞经体外成熟培养并受精后，其卵裂率（分别为：４８．８％，７０．９％，８４．４％，８２．１％，６８．２％）及囊胚发育率（分别为：０．０％，１７．８％，３３．３％，５４．６％，２５．０％）除异常者外均随着卵丘细胞层数的增加而提高（Ｐ＜０．０５）。对含有２～６层卵丘细胞的卵母细胞成熟后进行不同程度的剥离处理。然后按剥离程度分为３组：（１）全部剥离；（２）仅剩放射冠；（３）放射冠外有２～３层卵丘细胞。受精后３组间的卵裂率无显著差异（分别为：８１．７％，８５．２％，８４．４％）。而囊胚发育率（分别为：１６．８％，２３．８％，２３．４％），全部剥离组明显低于其他两组（Ｐ＜０．０５）。试验结果表明卵丘细胞对卵母细胞的体外成熟有促进作用，从而影响随后的受精及胚胎发育。     

山羊卵母细胞体外受精方法的研究

优化山羊体外受精条件,为提高体外成熟卵母细胞的受精质量和数量提供理论基础。对肝素、咖啡因、钙离子载体IA三种获能物比较,发现肝素和钙离子载体组受精率分别为56.0%和67.0%,显著高于咖啡因组21.0%(P<0.05)。卵裂率反而是肝素高于钙离子载体和咖啡因组,分别为51.1%、36.3%和19.0%,差异显著(P<0.05);发育到囊胚后,分别为17.8%、11.7%和0,肝素组与钙离子载体组差异不显著。结果表明肝素效果比较稳定。Percoll法处理精子卵裂率高于上浮法,差异显著(59.1%vs42.9%,P<0.05);但是囊胚的发育率分别为11.8%和7.8%,囊胚的平均细胞数分别为116和113,两者差异不显著。