甘蓝自交不亲和决定因子的体外表达和相互作用的检测

 S位点受体激酶(SRK)和S位点富含半胱氨酸蛋白/S位点蛋白11(SCR/SP11)分别为甘蓝自交不亲和(self-incompatibility, SI)信号传导的雌雄决定因子。为了深入研究两者的作用机理和进行人工调控，本研究以结球甘蓝ZQ为材料，利用pET·NusA融合蛋白表达系统，将包含SRK胞外域和跨膜域的mSRK蛋白和SCR蛋白在大肠杆菌BL21中融合表达，经SDS-PAGE电泳检测表达出融合蛋白大小分别约为116 kD和74 kD。进一步将两融合蛋白进行体外相互作用的检测，结果表明mSRK与SCR蛋白能够相互结合形成稳定的复合体，这为下一步实现SRK-SCR复合体聚合与解离的人为调控提供了技术平台。     

甘蓝自交不亲和信号传导元件ARC1的体外表达及其与SRK相互作用验证

在甘蓝自交不亲和信号传导中ARC1和上游因子SRK之间可能存在相互作用。为进一步证实该相互作用,以甘蓝E1为材料,采用RT-PCR技术扩增ARC1的编码序列, 构建ARC1原核表达质粒pET43.1a-ARC1,转化宿主菌大肠杆菌BL21,通过SDS-PAGE检测该蛋白的表达。利用免疫共沉淀原理及pET43.1a-ARC1融合蛋白序列中的6×His标签与Ni⁺结合的特点建立了体外检测蛋白质相互作用的新方法, 并用该方法对ARC1与SRK的相互作用进行了检测。结果表明,在体外ARC1能与SRK相互作用并形成复合体,这为深入分析ARC1与SRK相互作用机理以及探讨ARC1与下游传导元件的相互作用提供了理论和技术基础。     

Self-incompatibility in Brassicaceae crops: lessons for interspecific incompatibility

Most wild plants and some crops of the Brassicaceae express self-incompatibility, which is a mechanism that allows stigmas to recognize and discriminate against “self” pollen, thus preventing self-fertilization and inbreeding. Self-incompatibility in this family is controlled by a single S locus containing two multiallelic genes that encode the stigma-expressed S-locus receptor kinase and its pollen coat-localized ligand, the S-locus cysteine-rich protein. Physical interaction between receptor and ligand encoded in the same S locus activates the receptor and triggers a signaling cascade that results in inhibition of “self” pollen. Sequence information for many S-locus haplotypes in Brassica species has spurred studies of dominance relationships between S haplotypes and of S-locus structure, as well as the development of methods for S genotyping. Furthermore, molecular genetic studies have begun to identify genes that encode putative components of the self-incompatibility signaling pathway. In parallel, standard genetic analysis and QTL analysis of the poorly understood interspecific incompatibility phenomenon have been initiated to identify genes responsible for the inhibition of pollen from other species by the stigma. Herewith, we review recent studies of self-incompatibility and interspecific incompatibility, and we propose a model in which a universal pollen-inhibition pathway is shared by these two incompatibility systems.     

基于SRK和SCR序列的甘蓝自交不亲和系单倍型分析

采用RT-PCR和其他分子生物学方法,以甘蓝自交不亲和系E1和F1柱头cDNA为模板扩增SRKE1和SRKF1基因,以花药cDNA为模板扩增SCRE1和SCRF1基因.经序列比对首次证明E1和F1材料分别为S28和S7单倍型.经三维结构分析,预测SCRE1上C5-C6和C7-C8之间氨基酸序列决定SCRE1的单倍型特异性,SRKE1上TNNSFYSRLKVS序列决定了SRKE1的单倍型特异性,并对两者相对作用的关键氨基酸位点进行了分析.     

基于SRK基因序列分析的甘蓝自交不亲和系单倍型鉴定及验证

根据甘蓝自交不亲和性雌蕊决定因子SRK基因保守序列设计简并引物,克隆23份甘蓝自交不亲和系SRK基因并测序。利用NCBI数据库进行克隆序列的Blast比较以及序列之间的相似性分析,初步确定23份甘蓝自交不亲和系分属于SRK3、SRK7、SRK8、SRK16、SRK28、SRK36、SRK45、SRK46、SRK58、SRK68等10种S单倍型。其中有5份甘蓝自交不亲和系属于SRK36单倍型,占参试自交不亲和系的22%;SRK7、SRK16和SRK58单倍型均只有1份甘蓝自交不亲和系。进一步对不同自交不亲和系之间花期杂交后花粉萌发及花粉管伸长情况进行荧光显微观察,并对20个杂交组合的花期杂交亲和指数进行调查分析,结果表明根据SRK基因序列所确定的相同S单倍型自交不亲和系之间花期授粉表现为不亲和,花粉在柱头上萌发受阻,花期亲和指数低;而不同S单倍型自交不亲和系之间花期授粉表现高度亲和,花粉管伸入雌蕊正常,花期亲和指数高。表明基于SRK基因序列分析确定甘蓝自交不亲和系所属单倍型是一种简单而可靠的快速鉴定方法,有利于育种时有针对性地设计甘蓝自交不亲和系杂交组合配制,从而提高育种效率。     

利用酵母双杂交法检测甘蓝SCR与SRK之间的相互作用

为深入研究甘蓝S位点受体激酶(SRK)和S位点富含半胱氨酸蛋白(SCR)间相互识别的分子机理,以具有典型自交不亲和性的甘蓝D3为材料,利用巢式PCR分别扩增SRK胞外域(eSRK)和SCR,通过酵母双杂交检测二者之间的相互作用。并利用同源重组技术将eSRK与GAL4报告基因DNA活化域融合(pGADT7eSRK)以及SCR与GAL4报告基因DNA结合域融合(pGBKT7SCR)。两种重组质粒分别转化酵母Y187和Y2HGold后未出现自激活现象。融合的二倍体酵母(pGADT7eSRK× pGBKT7SCR)能在选择性固体培养基(SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-a-Gal/AbA)上生长,并且菌落呈蓝色。结果表明, eSRK与SCR蛋白能够相互结合, 为深入研究二者作用位点成功建立了一个技术平台。     

利用酵母双杂交系统鉴定羽衣甘蓝臂重复蛋白(ARC1)与结球甘蓝S位点受体激酶(SRK)激酶结构域的相互作用

S位点受体激酶(SRK)和臂重复蛋白(ARC1)是芸薹属植物自交不亲和反应的两种重要的信号元件,SRK-ARC1之间的互作决定着自交不亲和反应的进程。本研究利用PCR技术获得结球甘蓝(Brassicaoleracea var.capitata)SRK激酶结构域(SRKJ)的编码区以及羽衣甘蓝(B.oleracea var.acephala)ARC1基因不同片段长度的基因组DNA与编码区,分别构建以pGBKT7为载体的长度依次递减的ARC1a、ARC1b、ARC1c和ARC1d的重组诱饵质粒和以pGADT7为载体的SRKJ的重组猎物质粒,并将重组质粒转化酵母菌株进行蛋白质相互作用检测。结果显示:羽衣甘蓝ARC1存在5个连续的臂重复区,与结球甘蓝ARC1的氨基酸序列一致性达到98%;构建的重组表达载体在酵母细胞中无毒性和自激活作用产生;3个实验组Y2HGold[pGBKT7-ARC1a]×Y187[pGADT7-SRKJ]、Y2HGold[pGBKT7-ARC1c]×Y187[pGADT7-SRKJ]和Y2HGold[pGBKT7-ARC1d]×Y187[pGADT7-SRKJ]同时激活了4种报告基因AUR1-C...     

甘蓝SRK的S域及SCR酵母表达载体的构建及其相互作用区段的研究

 为了深入研究S位点受体激酶（SRK）和S位点富含半胱氨酸蛋白（SCR）甘蓝自交不亲和（self-incompatibility,SI）信号传导的雌雄决定因子的相互作用机制,以自交不亲和性高的结球甘蓝为材料,采用酵母双杂交体系,构建pGADT7-eSRKs和pGBKT7-SCRs重组载体,并分别转化到Y187和Y2HGold酵母中,通过SD/-Ade-His-Trp-Leu平板上菌落的形成,PCR以及x-α-gal显色反应鉴定转化到酵母中的两个重组质粒相互作用。结果表明,SRK S域的SRK1及SRK4分别与SCR2相互作用,且初步显示其相互作用区域为SRK第1个外显子的第16 ~ 421 bp的片段和SCR第1 876 ~ 2 068 bp的片段。这既为SRK-SCR相互作用提供了具体证据,也为甘蓝自交不亲和性分子机理的深入研究提供了新内容。     

槲皮素对甘蓝自交不亲和性及SRK活性的影响

 对甘蓝自交不亲和系‘022E1’, ‘022A1’, ‘02259’开花前两周的花蕾进行不同浓度的槲皮素处理, 开花后自交。与花期对照相比, 3个自交不亲和系的亲和指数差异达到显著性水平, 其中以1 500 μmol·L ^{- 1}槲皮素溶液处理效果最佳, 在022E1系中其亲和指数由原来的0.03增至4.35, 完全转化为了自交亲和系。采集开花前1 d的花蕾切取柱头进行SRK活性测定, 结果表明, 槲皮素处理后可显著抑制甘蓝自交不亲和系柱头中SRK活性, 从而阻止了自交不亲和性的信号传导, 达到了克服甘蓝自交不亲和性的目的。     

甘蓝BoSU03 蛋白基因的克隆及其与SRK 相互#br# 作用分析

 扩增了从甘蓝柱头蛋白质谱鉴定中获得的泛素蛋白BoSU03 基因的编码序列。序列分析表明 BoSU03 与甘蓝泛素蛋白Bol003815 的核苷酸序列相似性最高,达98%,含有臂重复结构域,属于植物泛 素蛋白家族。为探究BoSU03 是否为自交不亲和S 位点受体激酶（SRK）下游的互作蛋白,以SRK 与ARC1 相互作用为对照,利用GAL 酵母双杂交系统对SRK 与BoSU03 进行了相互作用验证,结果表明, BoSRK/BoSU03 的转化酵母在四缺平板SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol 3-AT 上长势较好,显色较 深,进一步检测发现BoSRK/BoSU03 转化酵母的β–半乳糖苷酶活性值大于BoSRK/BoARC1 转化酵母的 活性值,这为进一步分析鉴定BoSU03 是否参与SRK 下游信号传导过程提供了依据。