甘蓝SCR、THL与SRK交替相互作用的酵母双杂交检测

eSRK（S位点受体激酶胞外域）、SCR/SP11（S位点富含半胱氨酸蛋白-S位点蛋白11）和THL₁（类硫氧还蛋白）是甘蓝自交不亲和性信号传导过程重要的3个元件。利用PCR技术获得两种甘蓝SCR₂（class-Ⅱ）、eSRK₂（class-Ⅱ）、THL₁、SRKJ（class-Ⅰ，SRK₆激酶域）和eSRK₂₈（class-Ⅰ）的编码序列，并分别构建以pGBKT7为载体的SCR₂、THL₁的重组诱饵质粒和以pGADT7为载体的eSRK₂、eSRK₂₈、SRKJ的重组猎物质粒。利用酵母双杂交系统验证eSRK₂-SCR₂、eSRK₂₈-SCR₂、SRKJ-THL₁的相互作用。重组质粒在宿主细胞中未产生毒性及自激活作用，表明重组表达载体构建成功；组合Y2HGold〔pGBKT7-SCR₂〕×Y187〔pGADT7-eSRK₂〕在三缺平板（SD/-Trp-Leu-His/x-α-gal/AbA，TDO/x/A）上生长出蓝色克隆，激活了报告基因AUR1-C、MEL1、HIS3；组合Y2HGold〔pGBKT7-SCR₂〕×Y187〔pGADT7-eSRK₂₈〕能够在二缺平板（SD/-Trp-Leu）上生长，但在三缺平板上不生长，表明不同单倍型SRK-SCR可能不发生相互作用；组合Y187〔pGADT7-SRKJ〕×Y2HGold〔pGBKT7-THL₁〕能够在四缺平板上生长，激活了4种报告基因（AUR1-C、MEL1、HIS3、ADE2）。相同的单倍型SRK与SCR之间能够相互作用，不同的单倍型之间不会发生相互作用；酵母中报告基因表达的数目和类型的差异反映了class-Ⅱ型内部的SCR-SRK和class-Ⅰ的SCR-SRK互作强度，Ⅰ型高于Ⅱ型；THL与SRK之间存在较高的互作强度。这为Ⅰ型和Ⅱ型不同的自交不亲和性表型所依赖的3个起始信号传导元件之间的识别程度差异提供了直接证据和新内容。     

甘蓝SRK的S域及SCR酵母表达载体的构建及其相互作用区段的研究

 为了深入研究S位点受体激酶（SRK）和S位点富含半胱氨酸蛋白（SCR）甘蓝自交不亲和（self-incompatibility,SI）信号传导的雌雄决定因子的相互作用机制,以自交不亲和性高的结球甘蓝为材料,采用酵母双杂交体系,构建pGADT7-eSRKs和pGBKT7-SCRs重组载体,并分别转化到Y187和Y2HGold酵母中,通过SD/-Ade-His-Trp-Leu平板上菌落的形成,PCR以及x-α-gal显色反应鉴定转化到酵母中的两个重组质粒相互作用。结果表明,SRK S域的SRK1及SRK4分别与SCR2相互作用,且初步显示其相互作用区域为SRK第1个外显子的第16 ~ 421 bp的片段和SCR第1 876 ~ 2 068 bp的片段。这既为SRK-SCR相互作用提供了具体证据,也为甘蓝自交不亲和性分子机理的深入研究提供了新内容。     

甘蓝两种SRK短截蛋白的体外表达及其与THL1作用检测

 为探明S–位点受体激酶（SRK）上与类硫氧还蛋白1（THL1）作用的氨基酸区域以及两者间作用方式,依据SRK_E1上功能域分布构建了两种SRK_E1短截体原核表达质粒pGEX-SRK_E1A和pGEX-SRK_E1B,分别在大肠杆菌BL21中获得了可溶性表达。通过体外孵育检测蛋白质相互作用的方法对SRK_E1A、SRK_E1B与THL1相互作用进行了检测,结果表明SRK_E1A和SRK_E1B均可与THL1结合,明确了THL1与SRK相互作用并不依赖于SRK激酶活性。两类SRK等位序列间比对结果表明Cys在两类SRK间的保守性存在明显差异,推测两类SRK材料亲和性的差异可能与Cys保守性不同有关。     

甘蓝花粉管钙感应蛋白CaM 与SRK 相互作用研究

 为研究甘蓝花粉管钙感应蛋白CaM 与SRK 相互作用的分子机理及其可能相互作用的区域, 从自交不亲和甘蓝材料‘E1’中分别克隆得到CaM12 基因450 bp 及S 位点受体激酶（SRK7）基因全长 序列2 118 bp,并亚克隆得到SRK 胞外域（eSRK）和胞内激酶域（iSRK）,构建原核表达载体pGEX-CaM12、 pCold-eSRK 和pCold-iSRK,转化E. coli BL21（DE3）进行原核表达,表达产物纯化后进行体外相互作用, 结果表明CaM12 能够与SRK7 进行相互作用,但作用区域是iSRK7 而不是eSRK7。为进一步验证其相互 作用,本研究利用酵母双杂交系统,构建pGBKT7-CaM12、pGADT7-eSRK7、pGADT7-iSRK7 和 pGADT7-SRK7 酵母表达载体,转化相应酵母Y2HGold 和Y187 感受态细胞后未出现自激活和毒性现象, 相互作用结果与原核表达检测一致。同时将CaM12 的3 个EF-hands 结构域突变体CaM12-2-、CaM12-23- 和CaM12-234-与iSRK7 分别构建酵母表达载体pGADT7-CAM12-2-、pGADT7-CAM12-23-、pGADT7- CAM12-234-,检测其相互作用。结果表明CaM12 EF-hands 突变体CaM12-2-、CaM12-23-和CaM12-234- 在酵母双杂交系统中均不能与iSRK7 片段发生相互作用,说明CaM12 的EF-hands 结构域突变后失去结 合Ca2+能力而不能与iSRK7 相互作用。该研究可为自交不亲和机理提供新的参考依据。 关键     

甘蓝BoSU03蛋白基因的克隆及其与SRK相互作用分析

扩增了从甘蓝柱头蛋白质谱鉴定中获得的泛素蛋白BoSU03基因的编码序列。序列分析表明BoSU03与甘蓝泛素蛋白Bo1003815的核苷酸序列相似性最高,达98%,含有臂重复结构域,属于植物泛素蛋白家族。为探究BoSU03是否为自交不亲和S位点受体激酶(SRK)下游的互作蛋白,以SRK与ARC1相互作用为对照,利用GAL酵母双杂交系统对SRK与BoSU03进行了相互作用验证,结果表明,BoSRK/BoSU03的转化酵母在四缺平板SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol 3-AT上长势较好,显色较深,进一步检测发现BoSRK/BoSU03转化酵母的β-半乳糖苷酶活性值大于BoSRK/BoARCl转化酵母的活性值,这为进一步分析鉴定BoSU03是否参与SRK下游信号传导过程提供了依据。     

甘蓝BoSU03 蛋白基因的克隆及其与SRK 相互#br# 作用分析

 扩增了从甘蓝柱头蛋白质谱鉴定中获得的泛素蛋白BoSU03 基因的编码序列。序列分析表明 BoSU03 与甘蓝泛素蛋白Bol003815 的核苷酸序列相似性最高,达98%,含有臂重复结构域,属于植物泛 素蛋白家族。为探究BoSU03 是否为自交不亲和S 位点受体激酶（SRK）下游的互作蛋白,以SRK 与ARC1 相互作用为对照,利用GAL 酵母双杂交系统对SRK 与BoSU03 进行了相互作用验证,结果表明, BoSRK/BoSU03 的转化酵母在四缺平板SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/x-α-gal/25 mmol 3-AT 上长势较好,显色较 深,进一步检测发现BoSRK/BoSU03 转化酵母的β–半乳糖苷酶活性值大于BoSRK/BoARC1 转化酵母的 活性值,这为进一步分析鉴定BoSU03 是否参与SRK 下游信号传导过程提供了依据。     

大白菜渗透压应激活化蛋白激酶基因SRK2F的克隆与表达

以不耐盐、不耐旱的大白菜自交系SY-14-06为试材,提取根部总RNA,反转录为c DNA。根据大白菜SRK2F基因设计引物,PCR扩增SRK2F基因CDS序列1044bp。SRK2F编码347个氨基酸,预测分子量为39.3k D,理论等电点为4.88。利用p EASY-E1原核表达载体构建原核表达质粒p EASY-E1-SRK2F,转化表达菌株Transetta(DE3),通过SDS-PAGE检测该蛋白的表达。经Smart-embl预测其具有丝/苏氨酸激酶特有结构域,位于第4~260位氨基酸处。经Clustal X2比对,其与拟南芥同源性最高。最后利用镍离子金属螯合亲和层析介质对该蛋白进行纯化,得到了纯化的融合蛋白。     

普通西瓜3个变种45S rDNA和5S rDNA的染色体定位

【目的】为了探明普通西瓜种(Citrullus lanatus)3个变种间的亲缘关系和进化与驯化过程,【方法】利用双色荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH),将核糖体45S rDNA和5S rDNA在11份栽培变种(Citrulluslanatus subsp.vulgaris)、2份Egusi变种(C.lanatus subsp.mucosospermus)和3份Citroides变种(C.lanatus subsp.lana-tus)有丝分裂中期染色体上进行了定位研究。11份栽培变种西瓜和2份Egusi类型西瓜都含有2对45S rDNA位点和1对5S rDNA位点,3份Citroides变种都含有1对45S rDNA位点和2对5S rDNA位点。【结果】结果表明,普通西瓜种3个变种内部各基因型间具有相同的45S rDNA和5S rDNA分布模式,栽培变种和Egusi变种具有相同的分布模式,但它们均与Citroides变种存在明显差异,说明栽培变种与Egusi变种之间的亲缘关系更近一些。【结论】rDNA序列分布分析为在分子细胞学水平开展栽培西瓜的进化与驯化分析提供了证据。     

羽衣甘蓝ARC1 蛋白的原核表达、纯化及泛素连接酶活性分析

 ARC1 是植物特有的一类含有U-box/ARM 结构域的蛋白,在芸薹属植物自交不亲和 （self-incompatibility,SI）信号转导中起着正向调控因子的作用。将羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）BoARC1 编码区的序列连接到原核表达载体pET-14b 上,通过酶切鉴定和测序分析,构建pET-14b- BoARC1 表达质粒;将获得的阳性表达质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）pLysS 中,利用IPTG 进行诱导表达。SDS-PAGE 结果显示,在分子量69 kD 处有BoARC1 蛋白特异性地诱导表达;利用Ni2+-NTA 树脂通过亲和层析的方法获得BoARC1 融合蛋白。在泛素激活酶（E1）、泛素结合酶UBC7（E2）和泛素 体外泛素化反应后,通过免疫印迹的方法检测,显示出BoARC1 融合蛋白能够将底物进行多泛素化修饰; 当U-box 中保守位点第323 位Pro 突变为Ala 或其他泛素化组分缺少时,底物不能被泛素化修饰。     

萝卜抗真菌蛋白基因Rs-AFPs在大肠杆菌中的表达及其转化番茄的研究

 通过基因工程手段将萝卜抗真菌蛋白基因Rs-AFP_{1( 2)} 插入大肠杆菌表达载体pTrxFus中并诱导表达, 其融合表达产物约22 kD, 约占总可溶蛋白的0. 45% ( 0. 5%) 。抑菌活性试验表明: 重组Rs-AFP_{1( 2)}有抑菌活性, 其中Rs􀀁AFP2 较Rs􀀁AFP1 抑菌活性强。构建了Rs-AFP₂ 基因的植物表达载体pBIAFP₂。利用农杆菌介导法将pBIAFP₂ 导入番茄中, 并诱导出完整的植株32 株。对其中28 株进行PCR 和PCR-Southern Blot 检测, 其中17 株呈阳性。对经PCR Southern Blot 检测呈阳性的植株进行Southern Blot 检测, 6 株呈阳性。     

甘蓝LFY基因的克隆及序列分析

以甘蓝ZQ启动抽薹的茎尖为材料,分别提取DNA和RNA,以两对引物扩增并序列拼接得到甘蓝LFYZQ基因DNA序列和cDNA完整编码区,长度分别为2 560、1 239 bp,与花椰菜、拟南芥、芥菜和萝卜同源性分别达到91 %、87 %、86 %、87 %。该基因含有3个外显子（452、394、393 bp）和2个内含子（514、807 bp）,共编码412个氨基酸,内含子剪接位点均符合经典GT-AG法则。将LFYZQ与网上公布的12种十字花科植物LFY氨基酸序列按分子进化分成两类：甘蓝LFYZQ与花椰菜以及Jonopsidium属植物Jonopsidium acaule这3个分为一类;其余10种植物分为第二大类。LFYZQ蛋白分子量为46 kD,是一个不稳定的疏水蛋白,存在N-十四（烷）酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、酰胺化位点共4种活性位点。     

甘蓝柱头蛋白质双向电泳体系的建立

蛋白质提取方法和电泳条件是蛋白质组学研究中双向电泳的关键。为建立适合甘蓝柱头总蛋白质的双向电泳体系,本试验以甘蓝柱头为材料,采用改良TCA/丙酮沉淀法提取柱头总蛋白质,通过对IPG胶条、上样量、聚焦程序、SDS-PAGE胶浓度等的优化,建立了甘蓝柱头总蛋白质双向电泳体系,即选用长17 cm、pH 3～10 NL的IPG胶条,上样量150 μg,按照聚焦程序Ⅰ进行等电聚焦,第二向SDS-PAGE胶浓度选用12%,得到了分辨率高、重复性好的双向电泳图片。     

结球甘蓝和花椰菜幼苗叶面积系数的建立

通过分析结球甘蓝和花椰菜各3个品种幼苗叶长、叶宽乘积与叶面积间的关系,确定了每个品种的幼苗叶面积系数,并计算出结球甘蓝和花椰菜两种作物幼苗叶面积系数分别为0.681和0.630。同时证明结球甘蓝和花椰菜幼苗叶面积系数存在显著差异,不能建立共用的叶面积系数。     

槲皮素对甘蓝自交不亲和性及SRK活性的影响

 对甘蓝自交不亲和系‘022E1’, ‘022A1’, ‘02259’开花前两周的花蕾进行不同浓度的槲皮素处理, 开花后自交。与花期对照相比, 3个自交不亲和系的亲和指数差异达到显著性水平, 其中以1 500 μmol·L ^{- 1}槲皮素溶液处理效果最佳, 在022E1系中其亲和指数由原来的0.03增至4.35, 完全转化为了自交亲和系。采集开花前1 d的花蕾切取柱头进行SRK活性测定, 结果表明, 槲皮素处理后可显著抑制甘蓝自交不亲和系柱头中SRK活性, 从而阻止了自交不亲和性的信号传导, 达到了克服甘蓝自交不亲和性的目的。     

开花负调因子芥菜BjSVP与甘蓝BoFLC的异源互作研究

 为阐明开花负调因子BjSVP（源于种子春化型作物芥菜）与BoFLC（源于绿体春化作物甘 蓝）异源聚合后在开花调控路径中的互作机制,从芥菜酵母重组质粒pGADT7-BjSVP 分别亚克隆含MI、 MIK、K、IKC、KC、IK、IK1L1K2L2、IK1L1K2、IK1L1、IK1、I 结构域的11 个SVP 截短体（BjSVPΔ1 ~ BjSVPΔ11）, 构建猎物质粒pGADT7-BjSVPΔ1 ~ pGADT7-BjSVPΔ11 并转化酵母Y187 菌;从甘蓝中克隆了BoFLC 和 BoFLCzq 基因,构建诱饵质粒pGBKT7-BoFLC、pGBKT7-BoFLCzq 并转化酵母Y2HGold 菌。酵母双杂 交表明：芥菜BjSVP 能与甘蓝BoFLC 相互作用,在QDO/X/A 培养基上长出蓝色菌落,激活酵母报告基 因AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1。截短体BjSVPΔ2 ~ BjSVPΔ5 也能与BoFLC 相互作用,而BjSVPΔ7 ~ BjSVPΔ11 不能与BoFLC 互作。由此表明BjSVP 完整的K 域（BjSVP3）可独立作用于BoFLC,但K 域 亚域（K1、K2、K3）或者连接区（L1、L2）缺失突变后不能介导该作用。作用强度分析表明：BjSVP 的I 域能增强该蛋白互作,但M 域和C 域可能会干扰该作用;芥菜BjFLC 被甘蓝BoFLC 或BoFLCzq 替 换后,可明显增加作用强度;甘蓝FLC 的I 域第20 位、K 域第65 位和C 域第32 位氨基酸的变异很可能 与作用强度相关。     

基于SRK基因序列分析的甘蓝自交不亲和系单倍型鉴定及验证

根据甘蓝自交不亲和性雌蕊决定因子SRK基因保守序列设计简并引物,克隆23份甘蓝自交不亲和系SRK基因并测序。利用NCBI数据库进行克隆序列的Blast比较以及序列之间的相似性分析,初步确定23份甘蓝自交不亲和系分属于SRK3、SRK7、SRK8、SRK16、SRK28、SRK36、SRK45、SRK46、SRK58、SRK68等10种S单倍型。其中有5份甘蓝自交不亲和系属于SRK36单倍型,占参试自交不亲和系的22%;SRK7、SRK16和SRK58单倍型均只有1份甘蓝自交不亲和系。进一步对不同自交不亲和系之间花期杂交后花粉萌发及花粉管伸长情况进行荧光显微观察,并对20个杂交组合的花期杂交亲和指数进行调查分析,结果表明根据SRK基因序列所确定的相同S单倍型自交不亲和系之间花期授粉表现为不亲和,花粉在柱头上萌发受阻,花期亲和指数低;而不同S单倍型自交不亲和系之间花期授粉表现高度亲和,花粉管伸入雌蕊正常,花期亲和指数高。表明基于SRK基因序列分析确定甘蓝自交不亲和系所属单倍型是一种简单而可靠的快速鉴定方法,有利于育种时有针对性地设计甘蓝自交不亲和系杂交组合配制,从而提高育种效率。     

RAPD标记构建芥蓝×甘蓝分子标记连锁图

 以芥蓝C_100-12×甘蓝秋_50-Y7为杂交组合, 构建了F₂ 作图群体, 利用300 个随机引物对两亲本进行了RAPD 检测, 共筛选到150 个RAPD 引物在亲本间表现多态, 多态引物的比率为58. 3 %。共分析了52个引物产生的96 个多态性RAPD 标记在该群体中的遗传。96 个RAPD 标记中有94 个在F2 群体中的分离比符合3∶1 , 说明该群体适合于QTL 分析, 共发现两对共分离的RAPD 标记。利用该作图群体构建了甘蓝的基本遗传图谱。该图谱由9 个主要的连锁图构成, 覆盖基因总长度约为555. 7 cM。     

结球甘蓝叶片卷曲过程中6个生长素相关基因的克隆与表达分析

生长素在结球甘蓝球叶向上、向内自然卷曲的过程中发挥着重要的调控作用。为挖掘重要的影响结球甘蓝叶片卷曲的生长素相关基因,通过对结球甘蓝莲座期叶片与结球期叶片的转录组进行对比分析,筛选出6个显著差异表达的生长素相关基因,分别为调控生长素动态平衡的Bo ILL6、Bo ASA1基因,控制极性运输的Bo SF21、Bo PIN4基因,参与信号转导的Bo ARF8、Bo GH3.5基因。对上述6个基因进行同源克隆,分别获得全长c DNA序列,序列分析发现6个基因均含有生长素相关的结构域。分子进化树分析发现各基因与芜菁的对应基因遗传关系最近,拟南芥次之。荧光定量PCR检测结果显示,Bo ILL6、Bo ASA1与Bo SF21的表达量变化最为显著,结球期叶片相对莲座期叶片的表达量差异均高达12倍以上,变化趋势与转录组数据分析结果基本一致,说明这3个基因可能与结球甘蓝叶片的卷曲发育密切相关。