Study on Anti-viral Effect of Rhubarb on Porcine Epidemic Diarrhea Virus in vitro

The inhibitory effects of rhubarb on cell lesion, which was caused by porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), and its mechanism had been studied in this research.The maximum safe concentration of rhubarb solution applied to Vero cells was determined through morphological observation, and then the PEDV infected Vero cell model in vitro was established, by which the inhibitory effect of rhubarb on virus was studied.The experimental method had also been established based on this cell model.The result showed that the maximum safe concentration was 3.28 mg/mL.Both morphological observation and MTT assay were indicated that rhubarb could not only block the attachment of the virus to Vero cell and inhibit the synthesis and reproduction of the virus, but also could directly inactivate the virus.This research showed that rhubarb had an inhibitory effect on PEDV, and provided a theoretical basis for the prevention and treatment of clinical porcine epidemic diarrhea.     

猪流行性腹泻病毒S1D蛋白的优化表达及其单克隆抗体的制备

为进一步探究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S蛋白的抗原表位及其功能,本试验通过优化S1D基因的密码子,构建了S1D基因未优化的重组原核表达质粒pET-S1D和已优化的pET-ΔS1D,并进行了诱导表达和纯化。使用SDS-PAGE和Western blotting方法验证S1D、ΔS1D蛋白在大肠杆菌内得到正确表达,利用Image J软件对S1D、ΔS1D蛋白表达量进行灰度扫描,通过t检验分析两者差异性。将纯化的ΔS1D 蛋白免疫 BALB/c小鼠,通过细胞融合、筛选及亚克隆,获得单克隆细胞株。利用体内诱生法制备抗PEDV S1D蛋白的单克隆抗体腹水,使用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光试验3种方法对腹水效价及特异性进行检测和验证。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,表达S1D、ΔS1D蛋白的样品均在34 ku处出现正确的目的条带。t检验结果表明, S1D、ΔS1D两者蛋白表达量差异极显著(P<0.01)。ELISA结果显示, 腹水的抗体效价达到了1∶1 000 000,腹水与PEDV病毒粒子和纯化后的ΔS1D蛋白反应均呈阳性,与PEDV N蛋白、pET-32a(+)空载体蛋白和猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV) 5种病毒反应均呈阴性。Western blotting结果显示,腹水与ΔS1D蛋白和PEDV S蛋白分别在34和180 ku处有特异性条带出现,与pET-32a(+)空载体蛋白、正常Vero细胞蛋白均无特异性条带出现。间接免疫荧光试验结果显示,腹水及阳性对照组均能使细胞出现特异性绿色荧光信号,而空白及阴性对照组均未见绿色荧光信号。密码子优化可在原核表达系统中显著提高重组蛋白的表达水平,本研究基于高效表达的ΔS1D蛋白,成功制备了1株能稳定分泌与 PEDV S蛋白特异性结合的单克隆抗体的细胞株,为进一步探究 PEDV S蛋白抗原表位及蛋白功能的研究奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒中国地方流行株LJ/B03 M基因的克隆与序列分析

从黑龙江某猪场疑似猪流行性腹泻猪的粪便中提取总RNA，采用RT—RCR方法扩增，首次获得中国地方流行株PEDVM全基因序列，将其克隆到pMD18-T载体中进行测序，克隆的M基因核苷酸序列由681个核苷酸组成，含有一个完整的开放阅读框架，编码226个氨基酸。与国外已发表的其他毒株进行基因进化分析，GenBank中的6PEDV形成的基因进化树具有3个分支。其中分离株LJB／03形成一个独立的分支，说明LJB／03的M基因序列与其他毒株相比，发生了一定的变异。     

抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的研制及其特性鉴定

以新生乳猪增殖猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）,通过蔗糖密度梯度离心将其纯化,获得较为完整的病毒颗粒。病毒ＥＬＩＳＡ效价为１∶３×１０５,蛋白含量为３．９６ｇ／Ｌ。将提纯的ＰＥＤＶ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,取免疫鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合,融合率为９５．６％。用间接ＥＬＩＳＡ进行筛选,共检出３８个阳性孔,阳性率为２８．８％。对其中１５个阳性值较高的孔进行３次再克隆,阳性率达１００％,最后获得１５株稳定分泌特异性抗ＰＥＤＶ单抗（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞。ＥＬＩＳＡ阻断试验与交叉试验证明,其分泌的抗体具有高度特异性。腹水和细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ效价分别为１∶１０３～１∶１０６和１∶１２８～１∶５１２。经鉴定,１５株ＭｃＡｂ的分子类型均为ＩｇＧ,均无免疫沉淀特性。杂交瘤细胞的染色体数目为９０～１１０,平均９５。尤为重要的是,这些杂交瘤细胞所分泌的抗体,有的对ＰＥＤＶ具有中和作用,能够阻断病毒对猪只的侵害作用。     

2018-2020年中国部分省市猪流行性腹泻病毒S1基因的监测及遗传变异分析

【目的】 调查中国规模化猪场猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的流行情况。【方法】 利用RT-PCR检测方法对2018-2020年采集于全国11个省市318个规模化猪场的2 391份样品进行PEDV核酸检测,对30份阳性样品进行S1全基因扩增与测序,并利用MegAlign、Mega 7.0等软件进行分析。【结果】 2018-2020年,猪场PEDV核酸阳性率分别为48.57%、10.96%和4.72%,样品PEDV核酸阳性率分别为28.97%、8.27%和7.50%,猪场和样品PEDV核酸阳性率呈现逐年下降的趋势。S1基因相似性分析显示,获得的30株毒株全部为GⅡ基因型,其中17株毒株为GⅡa基因亚型、5株毒株为GⅡb亚型、8株毒株为GⅡc亚型,GⅡa基因亚型毒株为2018-2020年流行的主要毒株类型;30株毒株S1基因序列之间核苷酸相似性为93.0%~99.5%, 氨基酸相似性为91.7%~100%,其中22株毒株与2017-2018年流行的GⅡ基因型毒株相比S1氨基酸序列表现出特征性插入和缺失。【结论】 本研究结果为监测和分析中国PEDV的变异和演化提供了临床数据,为猪流行性腹泻防控和疫苗研制提供了参考。     

槲皮素对PEDV感染幼龄仔猪的生长性能、血液生化指标和肠道吸收与屏障功能的影响

【目的】 试验旨在探讨槲皮素在防治仔猪感染猪流行性腹泻病毒（PEDV）中的作用。【方法】 选取18头体重相近、健康的7日龄仔猪（杜×长×大）,随机分为3组（对照组、PEDV组和PEDV+槲皮素组）,每组6个重复,每个重复1头猪,试验期共11 d。经过3 d适应期后,于试验第4~10天给PEDV+槲皮素组仔猪口腔灌服10 mg/kg BW的槲皮素,其他组仔猪口腔灌服等体积的人工乳,于试验第8天给PEDV组与PEDV+槲皮素组仔猪口腔灌服1×10^4.5TCID₅₀的PEDV,对照组灌服等体积的PBS溶液。试验第11天早上空腹称重,全部仔猪灌服D-木糖（0.1 g/kg BW）,1 h后经前腔静脉采血,检测血液生化指标、血浆二胺氧化酶（DAO）活性和D-木糖含量;将所有仔猪屠宰取空肠黏膜,检测肠道屏障相关基因,包括肠绒毛蛋白（villin）,紧密连接蛋白-1（claudin-1）,闭合蛋白（occludin）和肠型脂肪酸结合蛋白（iFABP）的相对表达量。【结果】 与对照组相比,PEDV组仔猪平均日增重显著下降（P<0.05）,粪便评分显著升高（P<0.05）;血液中高密度脂蛋白含量显著降低（P<0.05）,肌酐和尿素氮的含量显著提高（P<0.05）;血浆中D-木糖含量显著降低（P<0.05）;空肠claudin-1、iFABP基因的相对表达量显著下调（P<0.05）。与PEDV组相比,PEDV+槲皮素组仔猪平均日增重和血浆D-木糖含量显著升高（P<0.05）;血液中肌酐和尿素氮的含量显著降低（P<0.05）;空肠claudin-1、villin和iFABP基因的相对表达量显著上调（P<0.05）。【结论】 10 mg/kg BW槲皮素可在一定程度上缓解PEDV感染导致的仔猪生长抑制和肾功能损伤,增强肠道吸收与屏障功能。     

槲皮素对PEDV感染幼龄仔猪肠道形态、抗氧化功能及空肠脂质代谢基因表达的影响

【目的】 通过研究槲皮素对猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染仔猪肠道形态、肠道抗氧化功能及空肠脂质代谢相关基因相对表达量的影响,旨在探讨槲皮素对PEDV感染仔猪肠道的保护作用。【方法】 选取18头健康的7日龄断奶仔猪,随机分为3组：对照组、PEDV组和槲皮素＋PEDV组,每组6个重复,每个重复1头猪。试验期8 d,于试验第0~7天,对槲皮素＋PEDV组仔猪每天口腔灌服10 mg/kg BW的槲皮素,其余组灌服等体积的人工奶。于试验第5天晚上给PEDV组和槲皮素＋PEDV组仔猪口腔灌服10^4.5TCID₅₀的PEDV,对照组仔猪灌服相同体积的PBS溶液。于试验第8天早上屠宰,取仔猪十二指肠、空肠、回肠及结肠组织样品进行检测。【结果】 与对照组相比,PEDV组仔猪空肠和回肠的绒毛高度以及绒毛高度与隐窝深度比值极显著降低（P<0.01）,空肠、回肠和结肠中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和总超氧化物歧化酶（T-SOD）的活力显著降低（P<0.05）,十二指肠、空肠、回肠和结肠中过氧化氢酶（CAT）的活力显著降低（P<0.05）,回肠和结肠中丙二醛（MDA）的含量显著升高（P<0.05）,空肠中载脂蛋白A1（APOA1）、载脂蛋白B （APOB）、载脂蛋白C2（APOC2）、脂肪酸结合蛋白2（FABP2）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员3（ACSL-3）和脂肪酸合酶（FASN）基因的相对表达量极显著下调（P<0.01）。与PEDV组相比,槲皮素＋PEDV组仔猪空肠和回肠的绒毛高度以及绒毛高度与隐窝深度比值极显著提高（P<0.01）,空肠、回肠和结肠中GSH-Px和T-SOD的活力显著提高（P<0.05）,十二指肠、空肠和结肠中CAT的活力显著提高（P<0.05）,回肠和结肠中MDA的含量显著降低（P<0.05）,空肠中APOB、FABP2和FASN基因的相对表达量极显著上调（P<0.01）。【结论】 添加槲皮素可有效缓解PEDV感染导致的仔猪肠道损伤,提高仔猪肠道抗氧化能力以及空肠脂质代谢的能力。     

PEDV、TGEV、RV多重RT-PCR检测方法的建立与应用

为了快速准确诊断猪流行性腹泻病毒 (PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)、猪轮状病毒(RV)引起的猪腹泻病,通过设计三对引物,建立了扩增PEDV、TGEV、RV的多重RT-PCR方法,用于临床上大量腹泻病料的鉴定。该方法特异敏感,能同时检测PEDV、TGEV、RV,而对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型病毒、乙型脑炎病毒、猪细小病毒等无扩增,检测的抗原稀释极限为107。用于35个猪场120份临床样品的检测,PEDV阳性率占37.5%,TGEV阳性率占0.75%,RV阳性率占1.25%。PEDV阳性病料测序结果分析表明,与近几年分离毒株亲缘关系较近,与经典毒株和疫苗株亲缘关系较远。结果表明建立的多重PCR方法特异性强、敏感度高,能用于临床诊断及流行病学调查。     

猪两种腹泻病毒混合感染的病原诊断

对我省流行的疑似猪病毒性腹泻进行了病原诊断，通过细菌培养、ＲＮＡ电泳和电镜形态观察等辅助诊断和免疫萤光特异性诊断，确诊该病病原为猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）与猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）的混合感染，混合毒代号为ＴＰＶ３。     

猪流行性腹泻病毒的RT-PCR鉴定及其 M、N和E基因的序列分析

对引起仔猪严重腹泻的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)进行RT-PCR检测,并对PEDV部分基因进行克隆和序列分析。从陕西省某发生严重仔猪腹泻的养猪场采集肠道内容物,利用RT-PCR技术成功检测到PEDV感染。克隆检测到的PEDV M、N和E基因片段,并将该基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他不同来源的PEDV毒株进行比较分析。结果表明,克隆的M、N和E基因与其他已经发表的PEDV毒株核苷酸的同源性分别为96.3%～99.9%、95.2%～99.5%和96.1%～96.9%,氨基酸同源性分别为95.6%～99.6%、96.1%～99.5%和96.1%～98.7%;系统进化树结果表明,试验检测的PEDV与国内分离株的PEDV株亲缘关系更近。可见:陕西省养殖场存在猪流行性腹泻病毒感染,其M、N和E基因变异不大。