绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法的建立与应用

[目的]建立一种诊断绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR方法,确定肺炎支原体感染的靶器官。[方法]根据GenBank网站上登录的绵羊支原体16S rRNA基因序列,设计并合成2对引物,以肺炎支原体菌株基因组DNA为模板,经过PCR反应条件的优化,通过测序验证扩增产物的正确性,建立了绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR检测方法,进而应用建立的方法完成临床阳性病料肺脏、肺淋巴、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、皮肤、小肠和外周血检测以及疑似样本肺脏组织的检测。[结果]建立的巢式PCR方法可扩增出864 bp的特异性目的片段,肺脏和肺淋巴为绵羊肺炎支原体感染的靶器官,临床样本巢式PCR检出率与支原体培养鉴定结果的符合率为100%。[结论]建立的绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法可用于临床样本的实验室诊断。     

狂犬病病毒CVS-11株间隔区缩短的缺失株构建及特性研究

为了探究狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)基因间隔区对狂犬病病毒生物学特性的影响,试验以狂犬病病毒CVS-11株为母本株,将其基因间隔区碱基均替换为胞嘧啶和胸腺嘧啶,分段扩增后与真核表达载体进行同源重组,运用反向遗传技术进行重组病毒拯救,经过菌液PCR鉴定和直接免疫荧光检测获得重组病毒rCVS11-2222。结果表明:重组病毒基因组稳定,重组病毒rCVS11-2222在细胞中的复制表现出与CVS-11株相似的特点;小鼠存活率显著降低。说明狂犬病病毒CVS-11株基因间隔区的缩短增强了原毒株的致病力。     

玫瑰SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

以玫瑰为试材,采用L16(45)正交设计和单因素试验2种方法,研究模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物和Taq酶5个因素对玫瑰SCoT-PCR反应体系的影响,建立最优化的反应体系并筛选合适引物。结果表明:模板DNA浓度为1.50ng/μL,Mg2+浓度为2.00mmol/L,dNTPs浓度为0.35mmol/L,引物浓度为0.70μmol/L,Taq酶用量为0.50U时,可建立玫瑰SCoT-PCR最佳反应体系,并筛选出20条扩增条带清晰、多态性丰富的SCoT引物。反应体系的优化及引物的筛选,为日后利用SCoT分子标记技术对玫瑰进行相关研究提供理论依据和技术支持。     

玫瑰自然杂交后代数量分类及SCoT标记研究

利用数量分类和SCoT分子标记两种方法对40个玫瑰自然杂交后代进行分类、遗传多样性研究。数量分类将40个玫瑰自然杂交后代分为5类：第一类包括Z1、Z15等20个样品,主要特征为花色粉色至深粉,重瓣花,花萼不反卷,花梗刺着生均匀;第二类包括Z10、Z17等6个样品,主要特征为花色紫红,单瓣花,花萼反卷,花梗刺分布均匀;第三类包括Z12、Z38等12个样品,主要特征为花色浅粉至粉,重瓣花,花萼不反卷,花梗刺着生位置多为中下部;Z11和Z34分别为第四类和第五类,主要区别特征为花色,分别为浅黄和白色。SCoT分子标记筛选出的20条引物共扩增出426条带,多态性条带379条,多态性比例为88.97%。选用UPMGA法对供试样本进行聚类分析,聚类结果将40个玫瑰自然杂交后代分为5类,与数量分类结果基本一致。数量分类和SCoT分子标记方法对本项研究适宜可行,40个玫瑰自然杂交后代遗传多样性表现丰富,亲本来源的多样性使得玫瑰的分类体系与之前研究结果相比增加了2个类系。本研究为科学利用玫瑰自然杂交后代和培育玫瑰新品种提供理论依据。     

貉细小病毒SD1607株的分离鉴定及VP 2基因序列分析

从疑似患细小病毒性肠炎的貉子肠道组织样品中分离到一株貉细小病毒(RDPV-SD1607)。为研究其分子遗传特征,对该分离株VP2基因进行克隆序列分析,结果显示,RDPV-SD1607的VP2序列与RDPV-HB3的相似性最高,为99.49%,属于CPV-2亚型;利用其核苷酸序列建立系统进化树发现,RDPV-SD1607处于犬细小病毒分支,且处于CPV-2亚型和CPV-2a亚型分支之间。结果表明,RDPV-SD1607株与犬细小具有共同的遗传起源,推测其可能正处于CPV-2亚型向CPV-2a亚型进化的中间状态,或是CPV适应貉而形成的新毒株。     

土壤温度对土壤性质的影响及调节作用

本文叙述了土壤热量的来源,以及土壤温度对有机质和N素的累积、土壤P素供应、土壤K素容量和强度、土壤电导性、土壤水分状况、土壤生物学过程等土壤性质的影响,进而提出了土壤温度调节的必要性和一些措施.     

分枝杆菌噬菌体CJAUS5株holin基因的克隆与序列分析

为了研究噬菌体裂解宿主菌的机制,开发噬菌体裂解相关蛋白的应用价值,试验参照Gen Bank中登录的holin基因序列设计特异性引物,以分枝杆菌噬菌体CJAUS5基因组为模板,经PCR扩增出411 bp的条带。构建重组质粒p MD19-T-holin,经双酶切鉴定呈阳性后进行测序分析。结果显示,克隆出的holin基因与已知分枝杆菌肌尾噬菌体holin序列同源性高达99.03%~99.51%;编码的氨基酸同源性高达99%~100%。对holin基因编码的蛋白进行分析表明,Holin蛋白具有亲水性C端和两个跨膜区域。研究成功克隆了分枝杆菌噬菌体CJAUS5的holin基因并进行了氨基酸序列分析,为进一步研究Holin蛋白的生物学特性及功能奠定了基础。     

草花苗期耐盐性鉴定及综合评价

本试验以15种草花为对象,采用NaCl对其幼苗进行盐胁迫处理,以预试验方式研究不同浓度NaCl对草花幼苗鲜重干重、根冠比等生长指标以及叶片抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性、脯氨酸含量等生理指标的影响,并在预试验筛选确定适宜盐胁迫浓度的基础上测定计算该浓度胁迫下各草花的植株形态和生理指标,并对两类指标进行相关性、主成分及聚类分析,对15种草花幼苗的耐盐性进行鉴定评价。结果表明：只有金盏菊的地上部鲜重干重高于对照,其它草花的地上部鲜重干重、地下部鲜重干重均受到不同程度的抑制。耐盐草花金盏菊和向日葵的MDA含量低于对照,盐敏感草花小丽花的MDA含量是对照的3.5倍。耐盐性强的草花(向日葵、金盏菊)其脯氨酸含量增加程度极显著高于盐敏感草花(蜀葵、蒲公英,等)。主成分分析结果显示,相对含水量、根冠比、SOD活性、脯氨酸含量可作为草花幼苗耐盐性的主要鉴定指标。聚类分析结果显示,15种草花苗期的耐盐性可划分为四类：第一类包括小丽花、万寿菊和蜀葵,其耐盐性最弱;第二类包括耧斗菜、假龙头、须苞石竹和百日草,其耐盐性较弱;第三类包括蒲公英、波斯菊、松果菊、半枝莲、常夏石竹和地被菊,其耐盐性较强;第四...     

干酪乳杆菌对产肠毒素大肠杆菌粘附Caco-2细胞抑制作用的研究

为研究干酪乳杆菌(L.casei)对人结肠癌Caco-2细胞的粘附特点及抑制产肠毒素大肠杆菌K88(ETEC K88)粘附Caco-2细胞的能力,本研究将不同浓度的L.casei和ETEC K88与分化完全的Caco-2细胞共培养2 h和4 h后,采用平板计数法和革兰染色法计算每个细胞上粘附菌的个数,评价L.casei的粘附特点及其抑制ETEC K88对Caco-2细胞的粘附能力,并分析其影响因素。结果表明,L.casei与ETEC K88均可以粘附至Caco-2细胞表面,并且随菌液浓度的升高和培养时间的延长,粘附的数量显著增加(p0.05)。L.casei浓度越高,抑制ETEC K88粘附至细胞表面的能力越强,并与菌液添加顺序有关,但培养时间对其影响不显著(p0.05)。本研究为L.casei抑菌作用机制的研究提供了实验依据。     

1株非洲猪瘟病毒自然变异毒株的鉴定

非洲猪瘟(ASF)于2018年传入我国后已流行了2年有余,我国非洲猪瘟病毒(ASFV)毒株未曾出现较大变异。最近,针对我国ASF疫情放缓以及感染猪出现的低死亡率现象,我们在ASFV生态学研究中,从主动监测的样品中分离到1株源自湖北某地的ASFV自然变异株。经基因组测序发现,其EP402R基因(CD2v)和上游相邻的EP153R基因(8CR)出现部分缺失,共计1252 bp,导致病毒血吸附特性丧失;在多处基因编码区和基因间隔区出现独有的碱基突变、缺失或插入,与国内已经发表的10个ASFV毒株完全不同,这些变化导致病毒蛋白氨基酸组成的改变和功能丧失;在基因组3′末端出现503 bp串联重复的核酸片段插入,该片段与国外毒株基因组末端部分序列有高达96%的同源性。该变异株不含任何已知标记基因,说明我国的ASFV已经出现了自然变异株,可能和目前呈现的亚急性型流行的ASF有关。