绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立检测绵羊家畜衣原体血清抗体的间接ELISA方法,本试验构建pET-28b-ompA重组表达质粒,经诱导表达和纯化后,对重组主要外膜蛋白(MOMP)进行Western blot鉴定;以MOMP为包被抗原,通过反应条件筛选建立绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法,分析其敏感性、特异性、重复性和符合性,并进行临床样品检测。结果显示,MOMP以包涵体形式表达,经Western blot鉴定重组蛋白具有良好的反应原性。优化反应条件为：抗原包被浓度为1 mg/L,37℃静置孵育1 h;血清抗体稀释倍数为1∶100,37℃反应1 h;酶标二抗稀释倍数为1∶5 000,37℃孵育1 h;底物显色条件为37℃避光5 min。利用52份绵羊血清确定ELISA方法的阳性判定临界值为P/N=2.156。该方法的敏感性、特异性和重复性较高。用该方法与间接血凝试验对86份血清进行检测,两者符合率为73.2%。用该方法对临床采集的205份绵羊血清样品进行检测,阳性率为34.1%。结果表明,本试验建立的绵羊家畜衣原体血清抗体间接ELISA检测方法具有较高的特异性和敏感性,可应用于临床检测。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白在本氏烟草中的表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)抗体间接ELISA检测方法,利用马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)介导的植物生物反应器在本氏烟草中表达ASFV p30蛋白,并以表达的蛋白作为包被抗原,对间接ELISA各反应条件进行优化。依据ASFV SY-18株的CP204L(p30)基因序列,按照本氏烟草密码子的偏好性,对p30基因(231～536 bp)的核苷酸序列进行优化、人工合成及克隆,通过In-Fusion连接技术将扩增的p30基因插入到PVY基因组的P1和HC-Pro基因之间,构建PVY-p30重组病毒质粒,以摩擦的方式将质粒接种本氏烟草叶片,14 d后,通过RT-PCR和Western blot分析目的基因的转录和重组蛋白的表达情况,并利用Ni-NTA-琼脂糖亲和层析柱纯化本氏烟草中表达的p30重组蛋白,Western blot分析p30重组蛋白的纯化效果和反应原性,将纯化后的p30重组蛋白作为包被抗原,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法。结果显示,构建的PVY-p30重组病毒能够系统性侵染本氏烟草;p30重组...     

基于截短MOMP蛋白的绵羊流产衣原体抗体间接ELISA方法的建立

为了建立检测绵羊流产衣原体MOMP(main outer membrane protein)蛋白抗体的间接ELISA方法,试验将编码MOMP蛋白的基因序列经密码子优化后进行基因合成,并克隆和原核表达截短蛋白,以该蛋白为抗原建立绵羊流产衣原体抗体的间接ELISA方法,优化该方法的反应条件,同时验证其特异性、敏感性和重复性,最后用该方法对临床待检羊血清进行检测,并与间接血凝试验试剂盒的检测结果进行比较。结果表明：截短蛋白MOMP_201～390的表达、纯化效果最好。经探索,优化后的间接ELISA方法最优反应条件：抗原包被浓度为1 mg/L,37℃包被2 h,待检血清最佳稀释度为1∶100,血清和酶标二抗的最佳作用时间分别为45 min、60 min。建立的间接ELISA方法的敏感性较高,特异性和重复性较好,使用该方法从209份临床待检羊血清样本中检出47份阳性血清,与间接血凝试验试剂盒分别检测临床待检羊血清样本86份,总符合率为80.23%。说明基于截短蛋白MOMP_201～390建立的绵羊流产衣原体抗体间接ELISA方法可用于绵羊流产衣原体临床血清...     

猪繁殖与呼吸综合征与大肠杆菌混合感染病例诊断报告

2014年3月,北京某规模化猪场发病,病猪表现为呼吸困难、耳朵发绀、体温升高、进食减少、眼结膜发炎等临床症状。通过组织病理学、分子生物学结合病原学方法,对该猪场病死仔猪检测分析。大体剖检结果显示肺脏干酪样变,肾脏肿大,淋巴结呈黑红色;组织病理学结果显示仔猪肺脏严重出血,肠道大面积坏死。PCR检测PRRSV和大肠杆菌阳性。综合诊断该猪场混合感染猪繁殖与呼吸综合征病毒与致病性大肠杆菌,从而导致严重的出血性肺炎和坏死性肠炎,引起仔猪死亡。     

基于截短绵羊鹦鹉热衣原体r MOMP183-390蛋白的间接ELISA检测方法建立与应用

为建立绵羊鹦鹉热衣原体(Cp)间接ELISA抗体检测方法，本实验将编码Cp主要外膜蛋白MOMP的omp A基因序列按大肠杆菌密码子偏好性优化后，合成质粒p ET-28b (+)-omp A，另外设计特异性引物，分别将omp A截短克隆至p ET-28b(+)载体中构建重组表达质粒p ET-28b(+)-omp A_1-182和p ET-28b(+)-omp A_183-390，测序鉴定正确后分别转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，经IPTG诱导并纯化后，经western blot鉴定3个重组蛋白，结果显示，重组MOMP_183-390蛋白(r MOMP_183-390)表达效果最好。以r MOMP_183-390作为包被抗原，采用方阵滴定法优化各反应条件，初步建立了检测Cp抗体的间接ELISA方法。采用建立的该方法检测羊痘病毒、布鲁氏菌、羊口疮病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒等羊临床常见病的阳性羊血清，结果显示，除Cp外，该方法与其他阳性羊血清均无交叉反应，特异性强；将C...