一例鸡传染性囊病的诊断及病毒分离鉴定

为获得目前引起传染性囊病的病毒对2017年5月山东青岛某蛋鸡养殖场疑似感染传染性囊病的病例进行了诊断和病毒分离。采用琼脂糖免疫扩散试验诊断该病;SPF鸡胚培养、动物接种分离培养病毒,用RT-PCR和琼扩试验鉴定鸡胚分离病毒。结果在琼脂糖免疫扩散试验中该病毒能与传染性囊病阳性血清呈现白色沉淀线;在SPF鸡胚接毒后第3~4天出现鸡胚死亡现象,且胚体皮下出血、绒毛尿囊膜增厚混浊等特征;RT-PCR反应中该抗原能利用特异性引物扩增出目的片段;对30日龄SPF鸡攻毒试验中出现腔上囊肿大,黏膜面有点状出血等病变。结果表明,在实验室确诊了传染性囊病并在鸡胚中成功增殖了该病毒。     

山东省外观健康羊群中检出羊边界病病毒

2014年从山东省外观健康的牛羊采集鼻拭子样品共707份,提取其RNA,用流感病毒特异性引物进行RT-PCR检测。对RT-PCR扩增的阳性产物进行序列测定,意外发现其中1份羊拭子样品含有羊边界病病毒,并且该结果得到其他试验验证。结合我国2012年首次在安徽和江苏两地检出该病毒,以及当前我国羊群流通情况,推测该病毒可能在我国有所存在。该调研结果对分析各类RT-PCR检测的假阳性产生原因,有参考意义。并提示RT-PCR检测结果难以作为疫病或感染病诊断的确切依据。其诊断结果有时需要用荧光探针或测序进行进一步鉴定。     

水貂绿脓杆菌(PASD03)鞭毛蛋白免疫原性的研究

为了研究水貂绿脓杆菌(PASD03)鞭毛蛋白的免疫原性,采用酶联免疫吸附试验、琼脂扩散试验、试管凝集试验和免疫印迹试验,对鞭毛蛋白免疫的兔抗血清进行了检测。结果表明:酶联免疫吸附试验呈阳性反应,血清稀释倍数在1∶80~1∶100之间最好;免疫扩散试验抗体效价达1∶64,试管凝集试验抗体效价在1∶1 600~1∶3 200之间;免疫印迹试验在53.0 ku左右出现1条特异性条带。说明检测的鞭毛蛋白具有较高的抗原性,为有效控制水貂绿脓杆菌病提供了新型候选疫苗源。     

猪链球菌2型的分离鉴定及致病性试验

从济南某猪场急性死亡的病例中,采集猪心血、肺、肝、脾和淋巴结等组织器官,通过病原分离,药敏试验,猪链球菌2型荚膜多糖基因(cps2J)的PCR检测及动物试验分别对其进行病原、药物敏感性、血清型和生物学特性等初步研究。结果表明:分离菌的形态、培养特性及生化特性符合链球菌的特点,cps2J基因PCR扩增均出现长度为675 bp的特异性条带,其核苷酸序列与GenBank中猪链球菌2型参考菌株的cps2J基因序列同源性达98%～100%,由此证明其病原菌为猪链球菌2型。对小鼠的致病性试验表明能100%致死小鼠。     

抗伪狂犬病病毒gC抗体制备及其gC蛋白表达

用纯化的重组蛋白His-gCN813制备抗PRV-gC抗体,并分析伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）gC蛋白在真核细胞的表达情况。本研究以提取的病毒基因组为模板,PCR克隆PRV gC全长基因,构建gC真核表达质粒p3xFLAG-gC,在真核细胞中表达gC基因;纯化蛋白His-gCN813制备的抗体,Western blotting和间接免疫荧光（IFA）检测到p3xFLAG-gC转染真核细胞和PRV感染细胞中的gC蛋白。结果表明本试验成功构建了PRV gC基因真核表达系统,获得了特异性抗PRV gC抗体,重组gC真核表达质粒p3xFLAG-gC转染Vero细胞,表达的重组蛋白gC为72 ku,PRV感染Vero细胞,表达的gC蛋白为55、72和94 ku,主要定位在细胞浆,gC蛋白可以作为PRV感染的指示分子,为下一步研究PRV和宿主相互作用及PRV的复制奠定了基础。     

H3亚型猪流感病毒HA基因核酸探针的制备与应用

以地高辛(DIG)标记H3亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的保守片段制成核酸探针,与H3及H1亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的cDNA、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的DNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA、猪伪狂犬病病毒(PRV)的DNA进行斑点杂交,检测探针的特异性.结果显示,该探针仅与H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA杂交呈阳性,与其余病毒杂交呈阴性;敏感性试验结果显示,探针最低能检出约6 pg/μL的H3亚型的SIV RT-PCR产物.应用该探针对35份疑似SI临床病料进行检测,结果检出4份阳性病料,与RT-PCR检测结果一致.研究表明,建立的DIG标记的核酸探针特异性强,敏感性高,适合于对H3亚型SI的诊断和流行病学调查.     

水貂IFN-α基因的克隆与原核表达

从水貂基因组中通过PCR的方法克隆得到干扰素α基因(IFN-α),将IFN-β成熟肽插入原核表达载体pET32a,在E.coliBL21(DE3)工程菌中表达重组蛋白。结果表明IFN-β片段长564 bp,与已报道的水貂干扰素-α基因相比同源性98%。IFN-α成熟肽可编码166个氨基酸。重组质粒经ITPG诱导6 h后蛋白表达产物较高,表达量占菌体表达量的50%,分子量约为36 ku,与预期结果相符。     

犬瘟热病毒F蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]获得犬瘟热病毒F蛋白特异性单克隆抗体。[方法]用纯化的大肠杆菌BL21表达的犬瘟热病毒重组F蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用传统的杂交瘤技术制备单克隆抗体。用ELISAI、FA、Western-blot、细胞中和试验鉴定各株单抗的生物学特性。[结果]获得7株稳定分泌犬瘟热F蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2D6,3E10,3A2,5B7,5F6,6H8,9B6);单抗亚类鉴定结果分别为IgG2a,IgG1,IgG2b,IgG1,IgG1,IgG2a和IgG1;细胞中和试验初步证实2株单抗(5B7,9B6)具有中和犬瘟热病毒感染Vero细胞的作用,中和效价分别为1∶320和1∶640;经ELISA相加试验证实7株单抗的作用位点不同,其中2D6,5F6的作用位点非常相近。[结论]该研究成功制备了7株抗犬瘟热F蛋白特异性单抗,为进一步研究犬瘟热病毒F蛋白和临床诊断打下良好的基础。     

热应激对鸡新城疫疫苗免疫效果的影响

本试验利用伊莎蛋雏鸡，分别接种新城疫油乳剂灭活苗和Ｎ－７９弱毒苗，油乳剂灭活苗免疫的各试验组抗体滴度稍有下降，与对照组间无明显的差异；Ｎ－７９弱毒苗免疫的各试验组，高温处理２４小时的雏鸡，抗体滴度稍低于对照组，但无明显差异；而高温处理４８小时的各组，抗体滴度均显著低于对照组（ｐ＜０．０５）。     

轮状病毒套式PCR方法的建立

轮状病毒(Rotavirus,RV)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属.现已证实RV是婴幼儿和各种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原之一.猪RV在无其他病原存在的实验条件下可引起悉生猪和未食初乳的猪发生严重的胃肠炎和绒毛萎缩.RV的基因组由11节段的双股RNA组成.所有的11个节段都有同样的末端结构,具有5'm'GPPPPGm,3'末端无Poly(A)尾,单一长开放阅读框架(open readingframe,ORF'),缺乏聚腺苷酸序列.ORF两端为5'和3'端的非编码区(5'-and 3'-terminal untranslated regions,UTRs).