猪EIF2S3基因克隆测序及其组织表达谱分析

[目的]克隆猪EIF2S3基因mRNA全长,并进行生物信息学分析及检测其在猪各组织中的表达特征,为研究真核翻译起始因子2(eIF2)蛋白γ亚基的生物学功能打下基础.[方法]以荣昌猪胸腺mRNA为模板,采用RCAE-PCR克隆EIF2S3基因的mRNA全长序列,在线完成各种生物信息学分析后,利用实时荧光定量PCR分析猪EIF2S3基因的组织表达特征.[结果]猪EIF2S3基因mRNA全长1813 bp,其中蛋白质编码区(CDS)长1419 bp,5'UTR区、3'UTR区分别长14和380 bp,编码472个氨基酸.EIF2S3蛋白分子量51.1 kD,理论等电点(pI)8.62,包含58个带正电的氨基酸和52个带负电的氨基酸,其前体蛋白靠近N端区域有一个强疏水区;EIF2S3蛋白的空间结构由α-螺旋、β-折叠、延伸及无规则卷曲构成.EIF2S3蛋白氨基酸序列与狗和大白鼠的相似性最高(99.6%),其次是马、猫、牛、羊和人类(99.4%),与斑马鱼的相似性最低(96.6%).EIF2S3基因在猪的心脏、胸腺和淋巴组织中表达量较高,在脾脏和肌肉中呈中度表达,在肾脏中的表达量较低,而在肝脏中基本不表达.[结论]猪EIF2S3基因全长1813 bp,在核酸和氨基酸水平上与其他物种的EIF2S3基因高度同源,尤其与狗和大白鼠的遗传距离最近;其在猪心脏、胸腺和淋巴组织中的表达量较高,在肝脏中基本不表达,据此推测EIF2S3参与合成的蛋白更多地参与心脏泵血和免疫相关功能,基本不发挥能量代谢功能.     

荣昌猪、长白猪先天免疫候选基因筛选

旨在探究影响荣昌猪和长白猪机体先天免疫功能的候选基因.以新生荣昌猪、长白猪胸腺为研究对象,利用RNA-seq分析荣昌猪、长白猪胸腺组织中的差异表达基因,同时对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析,并通过qRT-PCR验证RNA-seq结果的准确性.结果表明:在新生荣昌猪和长白猪胸腺中,差异倍数在2倍以上的基因共421个,其中,荣昌猪相对长白猪上调的有231个,下调的有190个.GO富集分析发现,这些差异表达基因主要富集在清道夫受体活性、G蛋白偶联受体结合、T细胞活化、细胞分泌调节、胞吐作用调节、SNARE复合物组装调节等生物学过程.KEGG通路分析发现,这些差异表达基因主要参与细胞因子-细胞因子受体互作、cAMP信号、代谢(磷脂酶D、半胱氨酸和蛋氨酸)及一些疾病(非洲锥形病、癌症)相关信号通路.6个差异表达基因的RT-qPCR结果表明,此次RNA-seq的结果准确可靠.综合差异表达基因、GO和KEGG信号通路结果发现,TMSB15A和STAB2、SAA1和HP分别是荣昌猪和长白猪胸腺先天免疫的候选基因.     

猪CD127流式单克隆抗体的研制

[目的]研制出猪CD127(调节因子IL-7受体α链)流式单克隆抗体,为研究分析猪淋巴细胞亚群,尤其是猪Treg细胞亚群提供流式细胞分析抗体,也为进一步探究猪抗病性状与免疫机制间的关系打下基础.[方法]克隆猪CD127基因片段,通过原核载体诱导表达出相应的融合蛋白,以纯化后的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,然后取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,综合ELISA和流式细胞仪检测筛选出亚克隆抗体,并采用Western blotting验证所得亚克隆抗体能否与猪淋巴细胞上的CD127特异性结合.[结果]猪CD127基因cDNA全长1999 bp,第49~1428 bp为开放阅读框(ORF),编码459个氨基酸,其中前21位氨基酸为信号肽,成熟肽N端第1~219位氨基酸为胞外蛋白,第220~242位氨基酸为跨膜蛋白,第243~459位氨基酸为胞内蛋白.以pET28a和pET32a原核载体诱导表达CD127胞外片段可获得大小介于34~43 kD的融合蛋白,经Ni亲和层析柱纯化后用于免疫Balb/c小鼠,6只免疫小鼠血清中的多克隆抗体均能对猪淋巴细胞中的CD3阳性细胞(CD3+)进行共标记,其中以M2和M4两只免疫小鼠抗血清对CD3+的共标记效果较优,分群清晰;但流式细胞仪检测发现,仅2.3%的CD3+能与M2混合池培养基上清液中的分泌抗体共标记,而67.0%的CD3+能与M4混合池培养基上清液中的分泌抗体共标记,且分群清晰.从M4混合池中筛选出6株效价稳定的亚克隆细胞株(1E2、1D8、2F3、2F8、3C6和4E1),且以1D8、2F3、2F8和3C6亚克隆抗体标记的CD3+较多,其培养基上清液中的分泌抗体在猪胸腺和肌肉样品中均能检测出大小约50 kD的单一目的条带.[结论]制备获得的猪CD127流式单克隆抗体可与T淋巴细胞表面的IL-7受体特异性结合,同时在流式细胞仪检测过程中可用于猪Treg细胞亚群检测.     

5个重庆地方猪种遗传多样性的微卫星分析

为了分析5个重庆地方猪种的遗传多样性和系统发生关系,采用FAO-ISAG联合推荐的27个微卫星标记,以有效等位基因数、期望杂合度和多态信息含量等遗传参数为指标,评估了品种内遗传变异。计算了F统计量、Nei氏遗传距离(DA)和Nei氏标准遗传距离(DS)并进行UPGMA和NJ聚类分析及主成分分析,进而探讨了品种间的遗传分化和亲缘关系。结果,27个微卫星座位共检测到542个等位基因,其中43个等位基因为单一品种所特有。5个猪种的遗传多样性丰富:有效等位基因数(Ne)在9.4933～11.0280之间,期望杂合度(He)在0.8897～0.9091之间,多态信息含量(PIC)在0.8689～0.8926之间。F统计量分析表明,重庆地方猪种遗传分化明显(P0.001),各群体内存在一定程度的近交。2种聚类方法以NJ法更为可靠。5个猪种聚为两类,荣昌猪、渠溪猪和合川猪为一类,罗盘山猪和盆周山地猪为一类。相关性分析表明,遗传距离与地理距离间无显著的相关(P0.05)。该研究结果为重庆地方猪种的保护和利用提供了重要的理论依据。