小反刍兽疫实时荧光PCR检测方法的建立及应用

以小反刍兽疫病毒N基因序列为靶基因,通过设计引物及TaqMan探针建立快速检测小反刍兽疫的荧光PCR方法.在线BLAST分析结果表明:所设计的引物特异性强,可区分小反刍兽疫病毒及牛瘟病毒感染;所建立的方法检测线性范围为1～1×106拷贝质粒DNA,灵敏度可达10拷贝质粒DNA,是常规PCR法的100倍.应用所建立的方法对32份采自西藏疫区的组织样品进行检测,说明疫情在西藏没有扩散.     

亚欧型及南非型口蹄疫一步法多重荧光RT-PCR检测方法建立

 【目的】口蹄疫是一种严重的“政治经济病”,世界各国面临的口岸疫情防控形势均十分严峻。针对南非型(SATⅠ,SATⅡ,SATⅢ型)潜在入侵中国的严峻态势,为了防止疫情跨境传播,迫切需要建立有效甄别亚欧型(A、O、C及亚洲Ⅰ型)与南非型口蹄疫的检测方法,以进一步提高防控工作的准确性。【方法】选择口蹄疫病毒(FMDV)基因组保守的5'非翻译区(5'UTR)基因为靶序列,分别设计亚欧型及南非型FMDV特异的荧光PCR引物及Taqman探针,通过对反应体系和反应条件的优化,以插入扩增目的片段的阳性克隆质粒为模板,建立多重荧光PCR检测体系;进一步以体外转录cRNA作为阳性质控品,建立亚欧型及南非型FMDV一步法多重荧光RT-PCR鉴别方法,并进行敏感性、特异性确定及田间样本检测。【结果】本研究建立的FMDV多重荧光PCR检测方法,对亚欧型及南非型FMDV阳性质粒的扩增效率均在90%以上;以倍比稀释的体外转录cRNA作为模板,进行敏感性测试表明,本方法最低可检测至7.6×10-9ng 南非型cRNA和6.3×10-8ng亚欧型cRNA;特异性试验结果显示本方法可以有效甄别亚欧型与南非型FMDV;田间样本检测结果与样品实际感染情况一致。【结论】本研究建立的FMDV一步法多重荧光RT-PCR检测方法敏感、特异而且快速,为亚欧型与南非型口蹄疫的鉴别诊断及流行病学调查提供了新的方法。     

猪链球菌2型LUX荧光PCR检测方法的建立

猪链球菌2型是一种严重的人兽共患病病原,为满足猪链球菌2型快速检测的需要,本研究根据猪链球菌2型Cps2J保守区设计LUX引物,首次利用LUX PCR方法对猪链球菌2型进行检测,并进行了敏感性和特异性试验及模拟样品检测试验。结果显示,本研究建立的猪链球菌LUX 荧光PCR检测方法具有较好的敏感性和特异性,检测质粒样品的敏感性为10拷贝,检测模拟样品敏感性为10²拷贝,与无乳链球菌、巴氏杆菌、粪链球菌、马链球菌兽疫亚种、沙门氏菌等无交叉反应。该方法的建立为猪链球菌2型的快速检测提供了新的途径。     

应用荧光RT-PCR检测亚欧型口蹄疫病毒

根据口蹄疫病毒基因组的5’非翻译区序列比较保守的特点,采用软件设计亚欧型(A、O、C及Asia-1型)FMDV通用的引物和探针,经对反应条件和反应体系进行优化,建立了亚欧型FMDV的实时荧光RT-PCR检测方法。研究表明,该方法检测阳性质粒模板的线性范围为1.9×107-1.9×10拷贝,最低可检测19个拷贝。通过对FMDV各血清型(A、O、C、Asia-1及SAT-1,2,3型)的检测,证实该方法对亚欧型FMDV具有良好的特异性,能有效区分亚欧型和南非型FMDV感染。本研究为亚欧型口蹄疫的快速诊断和流行病学调查提供了新的方法。     

应用荧光RT-PGR检测亚欧型口蹄疫病毒

根据口蹄疫病毒基因组的5’非翻译区序列比较保守的特点,采用软件设计亚欧型（A、O、C及Asia-1型）FMDV通用的引物和探针,经对反应条件和反应体系进行优化,建立了亚欧型FMDV的实时荧光RT—PCR检测方法。研究表明,该方法检测阳性质粒模板的线性范围为1．9×10^7-1．9×10拷贝,最低可检测19个拷贝。通过对FMDV各血清型（A、O、C、Asia-1及SAT-1,2,3型）的检测,证实该方法对亚欧型FMDV具有良好的特异性,能有效区分亚欧型和南非型FMDV感染。本研究为亚欧型口蹄疫的快速诊断和流行病学调查提供了新的方法。