牛FSHR基因第4外显子多态性检测及序列分析

以西门塔尔和夏洛莱种公牛为对象,采用PCR-SSCP技术检测了促卵泡素受体(FSHR)基因第4外显子在西门塔尔、夏洛莱种公牛45个个体中的遗传多态性,结果发现多态性,旨在为研究该基因多态性与西门塔尔和夏洛莱种公牛繁殖性状的相关性提供理论依据,为筛选繁殖性状分子标记奠定基础.结果表明,牛FSHR基因第4外显子存在2个等位基因A和B,3种基因型分别为AA型、AB型和BB型.对多态片段的测序分析表明,FSHR基因第4外显子第38位碱基处发生碱基C→G的颠换,使得FSHR基因编码的受体胞外域部分出现一个脯氨酸到丙氨酸的变化,结合FSHR蛋白空间结构分析发现该氨基酸变化不直接影响FSHR与FSH的结合及FSHR转导信号能力.此外,据牛、绵羊、猪、马、人和大鼠FSHR基因第4外显子序列同源性比较表明:牛与绵羊该部分序列的同源最高为100%,与大鼠同源性最低为83%.     

GSTs-Mu基因的单核苷酸多态性与种公牛精液品质的相关性分析

谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)在致癌物质解毒及基因诱变等的过程中都发挥非常的重要的作用,因此可能影响公牛个体的精液品质。本实验选用长春中信集团种公牛繁殖中心的33头种公牛,通过PCR-SSCP技术,检测谷胱甘肽S-转移酶基因7个外显子扩增位点中是否存在突变;并对多态片段进行了测序,以确定突变的碱基类型和突变位点变异的位置;同时结合精液品质测定记录,对长春中信集团种公牛繁殖中心公牛的精液品质进行了相关分析。根据PCR-SSCP检测及测序结果得知:在谷胱甘肽S-转移酶基因外显子中,第5外显子的56bp位存在C→T的突变,但是由于该处的碱基位于密码子第2位,氨基酸由脯氨酸突变为亮氨酸。分析了33头种公牛谷胱甘肽S-转移酶基因的遗传多态性与精液品质的相关关系,谷胱甘肽S-转移酶基因的第5外显子AA型的鲜精活力、冻精活力、冻精活精子比率要显著高于AB型以及BB型。     

牛CAPN3基因多态性及与肉质性状相关性分析

以中国草原红牛、西门塔尔牛、利木赞牛、天一冈山黑牛为试验对象,利用PCR-SSCP结合测序的方法进行SNPs检测,并采用SPSS软件分析CAPN3基因的遗传多态性与肉质性状的关系。结果表明,仅在草原红牛及天一冈山黑牛中发现第46 414处（NC_007308）发生G→T的突变,且发生G→T突变的位点所对应不同基因型的个体,其大理石花纹、失水率、滴水损失和剪切力这些肉质性状存在显著差异,而西门塔尔牛和利木赞牛中未发现此突变。     

种公牛COX基因的单核苷酸多态性与精液品质的相关性分析

用长春优质肉种公牛繁育中心的33头种公牛,通过PCR-SSCP技术,检测细胞色素氧化酶（Cytochrome c ox-idase,COX）中存在的突变点,并对多态片段进行了测序,以确定突变的碱基类型和突变点的位置。根据PCR-SS-CP检测及测序结果得知：在细胞色素氧化酶基因的外显子中,第2外显子的92bp位处存在T→C的突变,该碱基位于密码子第2位,氨基酸由异亮氨酸突变为苏氨酸。同时结合精液品质测定记录,对长春优质肉种公牛繁育中心的33头种公牛的精液品质进行了相关分析,结果显示：细胞色素氧化酶基因的第二外显子CC型的活精子比率与CD型相比存在极显著差异（P〈0.01）,冻精活力存在显著差异（P〈0.05）。     

草原红牛与天一冈山黑牛背最长肌IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IG-FBP-4及IGFBP-5基因表达差异

本研究采用实时荧光定量RT-PCR技术检测了IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4及IGFBP-5基因在草原红牛与天一冈山黑牛背最长肌中的表达情况,旨在探求这些基因在草原红牛与天一冈山黑牛背最长肌中的表达规律。结果表明,所有5个基因在草原红牛与天一冈山黑牛背最长肌中均有表达;同时,IGFBP-1基因的mRNA在2种牛背最长肌中的相对表达量存在极显著的差异（P〈0.01）,其在草原红牛中的相对表达量是在天一冈山黑牛中的1.42倍;IGFBP-2基因的mRNA在2种牛背最长肌中的相对表达量存在显著的差异（P〈0.05）,其在草原红牛中的相对表达量是在天一冈山黑牛中的3.55倍;其他3个基因的相对表达量没有显著差异。本研究为深入研究IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4和IGFBP-5基因的生物学功能、了解这些基因对肉质性状的影响,以及对我国肉牛的改良提供理论依据。     

牛bta-miR-26b靶基因EphA2的鉴定

利用miRNA靶基因预测数据库TargetScan,RNA22对bta-miR-26b的靶基因进行预测,并鉴定bta-miR-26b的靶基因。生物信息学分析结果显示,在EphA2基因3′非编码区域（3′-UTR）有bta-miR-26b的保守结合种子序列。扩增含有bta-miR-26b结合位点的靶基因的3′-UTR区,插入双荧光素酶报告载体pmirGLo Dual-LuciferasemiRNA Target Expression vector,与bta-miR-26bmimics共转染Hela细胞后检测荧光素酶的活性变化。通过荧光素酶活性检测证明在体外bta-miR-26b可以与EphA2基因结合,证明EphA2可能为bta-miR-26b的一个靶基因。     

促黄体素受体LHR的一种剪接体在牛黄体不同发育时期表达量差异的研究

利用TaqMan—MGB探针实时荧光RT—PCR检测方法,对牛黄体中促黄体素受体（luteinizing hormone receptor,LHR）的一种剪接体（F类）在黄体4个不同发育时期（前,中,后,末）的相对表达差异进行了分析。同时将Real-time PCR中获得的数据用Realplex软件进行相对基因表达差异分析,应用SPSS软件对结果进行统计学分析。结果表明,LHR的F类剪接体在牛黄体发育的4个时期中,中期表达量是前期的0．535倍,后期表达量达到最高,是前期的5．65倍,末期显著下降是前期的0．0116倍,各个时期LHR的F类剪接体表达量间存在极显著差异（P〈0．01）。     

ADIPOQ shRNA在猪前体脂肪细胞中转染体系的优化

根据Genbank提供的猪ADIPOQ基因序列及shRNA设计原则,化学合成4段编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,将其定向克隆到pGPU6/GFP/Neo中U6启动子的下游,转化DH5α菌株,双酶切鉴定正确后进行测序,将构建好的真核表达载体转染前体脂肪细胞,并对条件进行优化.限制性内切酶PstⅠ和BamHⅠ酶切显示设计合成的shRNA编码序列被成功插入pGPU6/GFP/Neo质粒中,测序结果显示插入片断与设计序列完全一致,证明重组质粒构建成功,转入到前体脂肪细胞中,可以看见绿色荧光蛋白表达.当质粒浓度0.6μg,脂质体2000是1.2μL,两者质量/体积比为1∶2时,此时转染效率最高,达到53.9％.成功构建了猪ADIPOQ基因的shRNA真核表达载体,并成功将该质粒转入猪的前体脂肪细胞中去,还对质粒与脂质体2000用量比条件进行了优化,此举能为进一步研究ADI-POQ在猪前体脂肪细胞中的功能奠定了良好的基础.     

秋水仙素条件优化及其对牛卵细胞c-mos基因表达水平的影响

为探讨秋水仙素对牛卵母细胞产生细胞膜突起的最适条件与对减数分裂纺锤体组装起重要调控作用的母源基因c mos表达量的影响,设计如下试验:比较试验组(Deme+ sucrose处理)与对照组1(Deme单独处理)和对照组2(sucrose单独处理)的卵母细胞细胞膜突起率变化.用荧光定量检测最适合秋水仙素浓度处理的卵母细胞与空白组和对照组母源基因c-mos基因表达量的差异.结果表明,用0.6 mg/L秋水仙素+0.05 mol/L蔗糖处理牛卵母细胞1h细胞膜突起率达72.0％,要显著高于对照组1(13.0％)和对照组2(P＜0.05);0.6 mg/L秋水仙素浓度优于其他质量浓度(P＜0.05).秋水仙素加蔗糖处理的卵母细胞的母源基因c-mos表达高于蔗糖处理组和空白组c-mos基因的表达(P＜0.05).     

miR-26a和miR-30d在牛不同组织中表达规律分析

摘要：目的：检测miR-26a和miR-30d在牛不同组织中的相对表达水平,并应用生物信息学方法分析其靶基因,探讨两者在牛不同组织中可能发挥的作用。方法：以西门塔尔牛为研究对象,利用TRIzol一步法提取牛各组织总RNA后,根据miRBase提供的bta-miR-26a和bta-miR-30d成熟序列,设计特异性的反转录茎环引物以及荧光定量PCR引物,反转录获得cDNA后进行荧光定量PCR检测其在牛不同组织中的相对表达水平,并应用Targetscan、RNA22、miRDB等生物学软件预测其可能存在的靶基因。结论：miRNA-26a和miR-30d在牛心脏、肝脏等组织中均有不同程度的表达,miR-26a在心脏中表达量最高,其次在脾脏,在睾丸中的表达量最低。miR-30d在肾脏中表达量最高,其次在心脏,在睾丸中表达量最低。通过生物信息学方法分析miRNAs的靶基因,推测miR-26a和miR-30d可能参与调控机体的免疫、繁殖等活动。