牛FSHR基因第4外显子多态性检测及序列分析

以西门塔尔和夏洛莱种公牛为对象,采用PCR-SSCP技术检测了促卵泡素受体(FSHR)基因第4外显子在西门塔尔、夏洛莱种公牛45个个体中的遗传多态性,结果发现多态性,旨在为研究该基因多态性与西门塔尔和夏洛莱种公牛繁殖性状的相关性提供理论依据,为筛选繁殖性状分子标记奠定基础.结果表明,牛FSHR基因第4外显子存在2个等位基因A和B,3种基因型分别为AA型、AB型和BB型.对多态片段的测序分析表明,FSHR基因第4外显子第38位碱基处发生碱基C→G的颠换,使得FSHR基因编码的受体胞外域部分出现一个脯氨酸到丙氨酸的变化,结合FSHR蛋白空间结构分析发现该氨基酸变化不直接影响FSHR与FSH的结合及FSHR转导信号能力.此外,据牛、绵羊、猪、马、人和大鼠FSHR基因第4外显子序列同源性比较表明:牛与绵羊该部分序列的同源最高为100%,与大鼠同源性最低为83%.     

鸡干扰素α1及胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立

根据GenBank已发表的鸡干扰素α1(IFNα1)基因序列,设计1对特异性引物,采用PCR方法,从鸡基因组中扩增出鸡IFNα1基因.根据胸腺肽α1(THYα1)氨基酸序列,选用大肠杆菌偏爱密码子,设计基因序列,同时在IFNα1-THYα1之间设计1个5肽Linker.在IFNα1基因结构基础上,设计4条寡核苷酸单链作为下游引物,以搭桥的方式延伸和扩增,最终获得IFNα1-THYα1融合基因;将该基因克隆至pGEX4T-1栽体后,转化至BL21(DE3)受体茵中,37℃培养至茵液D600为0.6～1.0时,IPTG(1.0 mmol/L)诱导培养4 h;经western blor鉴定证实,成功构建了鸡干扰素al及胸腺肽d1融合蛋白原核表达系统,表达产物以包涵体形式存在,获得高纯度的IFNα1-THYα1蛋白.以细胞病变抑制试验及E玫瑰花结形成试验对目的蛋白进行体外活性检测,结果显示该蛋白具有生物活性.     

猫干扰素ω3与胸腺肽α1融合蛋白表达及活性检测

依据猫IFN-ω3和THY-α1的分子结构特征及大肠杆菌密码子的偏爱性设计引物,同时在IFN-ω3和THY-α1中间设计了1个(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)×3总共15肽的linker.采用搭桥PCR方法获得二者的融合基因.将该基因克隆至pBVIL载体中,构建了pBVIL-IFNω3-THYα1原核表达载体.将重组栽体转化至Rosseta(DE3)细胞中,经过IPTG诱导表达及蛋白质分离纯化,获得了质量浓度为0.78 g/L的IFNω3-THYα1融合蛋白.经E玫瑰花环形成试验和细胞病变抑制试验,结果表明E玫瑰花环形成率平均为23.4%,融合蛋白的活力值为7.4%,细胞病变抑制试验同阳性对照组结果基本一致,融合蛋白中的IFNω3、THYα1均较好地保持各自的生物活性,为IFNω3-THYα1融合蛋白进一步的开发和应用奠定了基础.     

犬干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立

依据IFNα1和THYα1的分子结构特征设计了1个连接肽,根据氨基酸序列和大肠杆菌密码子的偏爱性,采用PCR方法合成了三者融合基因,将该基因克隆至pGEX4T-2载体中,构建了pGEX4T-2-IFNα1-THYα1原核表达质粒。将重组质粒转化至BL21(DE3)受体菌中,37℃培养至D600为0.6~1.0时,IPTG(1.0 mmol/L)诱导培养4 h,经SDS-PEGA和Western-blot鉴定,目的蛋白获得高效表达。     

秋水仙素条件优化及其对牛卵细胞c-mos基因表达水平的影响

为探讨秋水仙素对牛卵母细胞产生细胞膜突起的最适条件与对减数分裂纺锤体组装起重要调控作用的母源基因c mos表达量的影响,设计如下试验:比较试验组(Deme+ sucrose处理)与对照组1(Deme单独处理)和对照组2(sucrose单独处理)的卵母细胞细胞膜突起率变化.用荧光定量检测最适合秋水仙素浓度处理的卵母细胞与空白组和对照组母源基因c-mos基因表达量的差异.结果表明,用0.6 mg/L秋水仙素+0.05 mol/L蔗糖处理牛卵母细胞1h细胞膜突起率达72.0％,要显著高于对照组1(13.0％)和对照组2(P＜0.05);0.6 mg/L秋水仙素浓度优于其他质量浓度(P＜0.05).秋水仙素加蔗糖处理的卵母细胞的母源基因c-mos表达高于蔗糖处理组和空白组c-mos基因的表达(P＜0.05).