牦牛CYGB基因CDS区克隆与生物信息学分析

【目的】丰富牦牛CYGB基因研究的基础数据,对牦牛CYGB基因的CDS区进行克隆和生物信息学分析。【方法】提取牦牛大脑海马区组织的总RNA并运用RT-PCR技术反转录为cDNA,并根据GenBank中普通牛CYGB基因cDNA序列（GenBank登录号：DV874786.1）,使用Primer3.0在线软件设计特异性引物,运用PCR扩增技术、TA克隆技术和核酸测序技术获得CYGB基因的完整CDS区序列及部分5′端和3′端UTR区,并使用ProtParam、PredictProtein、SWISS-MODEL等在线分析软件与Lasergene7.1软件包分析CYGB的一级结构、二级结构、三级结构与理化性质,并进行同源性分析及构建系统进化树;利用PyMol软件修饰并输出三维结构;使用在线亚细胞定位工具PSORT II Prediction预测蛋白质的亚细胞定位;使用Protfun软件对蛋白质的功能进行预测分析。【结果】克隆获得牦牛CYGB基因650 bp,包括CDS区573 bp(GenBank登录号：KF669898),碱基组成为A 20.59%、T 16.40%、G 33.33%、C 29.67%,编码190个氨基酸残基组成的蛋白质。与普通牛比对,牦牛CYGB基因在CDS区存在4个碱基突变,同源性为99.3%,这个突变未导致氨基酸序列的改变,4个突变均属同义突变。牦牛CYGB基因编码蛋白的分子式为C964H1513N263O278S7,分子量约为21.5 kD,理论等电点（pI）为6.32,消光系数为24075,不稳定系数为48.43,疏水指数为83.63,平均亲水性为-0.301,属不稳定可溶性酸性蛋白质,在哺乳动物网织红细胞内的半衰期为30 h。二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,其中α-螺旋占64.21%,无规卷曲占35.79%,属全α类蛋白质。三级结构是一个呈“three-over-three”三明治夹心型的α-螺旋折叠结构。亚细胞定位CYGB分布在细胞质(65.2%)、细胞核(17.4%)、线粒体(13.0%)、分泌系统的囊泡(4.3%)中,主要在细胞质,推测可能在能量代谢和辅因子的生物合成过程中发挥信号转导和转录因子调控的作用。牦牛CYGB氨基酸序列与普通牛、绵羊、家犬、小鼠、褐家鼠、原鸡、猴、黑猩猩、人的CYGB氨基酸序列的同源性分别为100%、98.9%、97.8%、95.3%、93.7%、78.8%、98.4%、95.8%和96.8%,物种之间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致,说明CYGB基因编码区在进化过程中比较保守。【结论】通过RT-PCR与TA克隆技术及核酸测序技术获得了牦牛CYGB基因全长573 bp的CDS区,并对其核苷酸序列和编码蛋白氨基酸序列及其蛋白结构和功能进行了分析,得知牦牛的CYGB是一个由190个氨基酸残基构成的可溶酸性蛋白质,在能量代谢和辅因子生物合成过程中发挥重要作用。CYGB基因编码区在长期生物进化过程中具有较强的保守性。该基因的成功克隆及分析为揭示牦牛CYGB基因的遗传特性提供了理论依据。     

甘肃河西地区西门塔尔杂交类群NGB基因第4外显子的遗传变异研究

为研究甘肃河西的临泽、甘州、凉州、金昌、高台5个地区西门塔尔杂交类群NGB基因第4外显子的遗传多态性及其变异特征,采用PCR-SSCP方法检测了283头西门塔尔杂交类群NGB基因第4外显子和部分内含子的多态性,并对群体内各等位基因进行了测序。结果显示:5个地区西门塔尔杂交类群共检测出5个等位基因(A、B、C、D、E),表现为6种基因型(AA、BB、AB、AC、AD、AE)。5个地区西门塔尔杂交类群均能检测到AA、BB、AB 3种基因型,且甘州、凉州、高台西门塔尔杂交类群还分别检测到AC、AD、AE 3种基因型。A等位基因频率在5个群体中最高,为优势等位基因。对不同SSCP带型的对应片段进行测序分析,共发现5个核苷酸突变位点(31 bp C→T、68 bp G→C和G→A、129 bp A→G、207 bp C→T),5处突变中仅第207 bp处单核苷酸突变落在外显子区域,其余均落在内含子区域,但均未导致氨基酸发生改变。χ2检验结果显示,5个地区西门塔尔杂交类群在第207 bp处单核苷酸突变位点上仅凉州、金昌西门塔尔杂交类群处于Hardy-Weinberg平衡状态(P0.05)。群体遗传学分析结果表明,临泽、甘州、凉州、金昌、高台西门塔尔杂交类群的多态信息含量(PIC)分别为0.358 2,0.383 9,0.427 9,0.368 2,0.394 7,均属于中度多态(0.25PIC0.5)。     

LPS刺激条件下鸡和鸭脾脏淋巴细胞归巢相关分子的比较研究

本研究旨在比较鸡和鸭在脂多糖(LPS)刺激下脾脏淋巴细胞归巢相关分子的差异性表达。腹腔注LPS 3h后,光镜和电镜下鸡和鸭脾脏红髓均可见大量的淋巴细胞和粒细胞,鸭内皮细胞间隙和椭球结构均较疏松,并可见迁移至椭球周围淋巴鞘PELS中的椭球相关细胞。Western blot显示内皮细胞间连接蛋白Claudin-10表达量在鸡脾脏显著升高,在鸭脾脏显著降低(P0.05);血管黏附蛋白VCAM-1在鸡脾脏表达量显著升高(P0.05),在鸭脾脏下降不明显。荧光定量PCR显示,LPS注射后淋巴细胞归巢基因MAd CAM-1,VCAM-1和Integrinα4在鸡脾脏中表达量均显著升高(P0.05),而在鸭脾脏中表达量显著降低(P0.05);调节细胞运动相关基因RHO-A和FAK在鸡脾脏表达量显著性下降(P0.05),Cdc42降低不明显,而RHO-A、FAK和Cdc42在鸭脾脏显著升高(P0.05)。LPS处理后鸡和鸭均产生了宿主免疫反应,并招募大量淋巴细胞和粒细胞参与炎症反应。鸡脾脏淋巴细胞归巢的发生主要归于内皮细胞与淋巴细胞之间的黏附作用;而鸭脾脏淋巴细胞归巢的发生可能归于两方面:一是细胞间调节紧密连接的蛋白表达量下降引起细胞间的渗透性增强,间接地促进了细胞的迁移,二是通过上调细胞迁移和运动方向的相关基因,进而增加淋巴细胞的迁移能力。本研究为鸡和鸭脾脏炎症刺激后淋巴细胞归巢的分子机制比较提供了基础。     

脑红蛋白在成年牦牛脑中的表达研究

【目的】探寻脑红蛋白(Neuroglobin,NGB)在成年牦牛脑不同部位中的分布特征。【方法】选择健康成年牦牛8只,宰杀后取其大脑皮质、小脑皮质、海马、延髓、纹状体及嗅球等部位的脑组织,利用免疫组织化学染色SP法和实时荧光定量PCR技术,对NGB在成年牦牛脑不同部位中的分布特征及定量关系进行观察与检测。【结果】NGB在成年牦牛脑不同区域的表达强弱有明显差异,在大脑皮质中NGB基因的相对表达量(262.69±9.19)极显著高于小脑皮质(137.00±7.29)、海马(1.00±0.22)、延髓(3.43±0.76)、纹状体(7.65±0.61)及嗅球(2.14±1.22)。【结论】NGB在成年牦牛脑不同部位中高表达,提示NGB在脑组织的氧利用及功能活动中发挥着重要作用。     

甘肃西门塔尔牛高台类群MSTN基因多态性与生物信息学研究

为分析甘肃西门塔尔牛高台类群MSTN基因的遗传多态性、变异特征及MSTN基因的基础数据。采用PCR-SSCP方法检测了62头高台西门塔尔牛MSTN基因的多态性,对群体内各等位基因进行了克隆,得到西门塔尔牛MSTN基因的完整CDS区序列及部分5'端和3'端UTR区,并进行了相关生物信息学分析。高台西门塔尔牛MSTN基因第1和3外显子只发现一种纯合基因型,第2外显子发现一种杂合基因型。序列分析结果表明,高台西门塔尔牛MSTN基因第2外显子在41bp处发生了C→T的突变,第1和3外显子无突变。生物信息学分析表明,西门塔尔牛MSTN基因CDS区全长1128bp,编码375个氨基酸残基组成的蛋白质,分子量约为42.5kD,理论等电点为6.14;二级结构是以β-转角和无规卷曲为主。西门塔尔牛MSTN与牦牛、绵羊等物种之间存在较高的同源性。统计结果表明,甘肃西门塔尔牛高台类群MSTN基因未发现有多态,对MSTN生物信息学的分析表明,甘肃西门塔尔牛高台类群MSTN是一个由375个氨基酸残基构成的不稳定的可溶酸性蛋白质,二级结构预测为一个混合型蛋白。本研究结果为进一步研究甘肃西门塔尔牛高台类群MSTN基因的遗传特性和生理机制奠定了基础。     

甘肃金昌西门塔尔牛MSTN基因外显子多态性研究

[目的]为分析金昌地区西门塔尔牛 MSTN 基因三个外显子的遗传多态性及变异特征。[方法]采用 PCR-SSCP 方法检测了61头西门塔尔牛 MSTN 基因三个外显子的多态性。[结果]显示：金昌西门塔尔牛 MSTN 基因的第1外显子存在 A、B 两个等位基因以及AA、AB 两种基因型,其基因型频率分别为0.7705和0.2295;第2外显子存在 A、B 两个等位基因以及 AA、AB、BB 三种基因型,其基因型频率分别为0.0328、0.3443和0.6229;第3外显子只有 AA 一种基因型。序列分析表明,金昌地区的西门塔尔牛 MSTN 基因第1外显子在269bp 发生了 A→G 的突变和第2外显子在41bp 发生了 C→T 的突变,但都未导致氨基酸发生改变,属于同义突变;外显子3并未检测到突变。[结论]统计结果表明,金昌地区的西门塔尔牛 MSTN 基因第1外显子呈低度多态,第2外显子呈中度多态。     

甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因外显子遗传变异的研究

为分析肉牛MSTN基因的遗传多态性及变异特征,采用PCR-SSCP方法检测了60头甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因的多态性,对群体内各等位基因进行了克隆测序。结果显示：武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子存在A、B两个等位基因以及AA、AB两种基因型,基因型频率分别为0.9167、0.0833;第2外显子存在A、B两个等位基因以及AA、BB、AB三种基因型,基因型频率分别为0.5、0.25、0.25。序列分析表明,武威西门塔尔牛MSTN第1外显子在269 bp发生了A→G的突变,第2外显子在41 bp发生了C→T的突变,二者均属于同义突变。统计结果表明,武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子呈低度多态,第2外显子呈中度多态,外显子3没有发生突变。     

不同微生态制剂对小鼠结肠损伤的修复作用研究

本试验旨在验证5种不同微生态制剂对于小鼠损伤肠道的修复作用。选用56只20～30 g、1月龄雄性昆明系小鼠，随机分为7个组，每组8只。以2%葡聚糖硫酸钠（DSS）水溶液连续饮水4 d建立结肠炎动物模型（模型组），空白对照组正常饮水，各试验组在DSS处理的基础上在1～8 d连续使用微生态制剂，分别口服0.2 mL细菌素（细菌素组）、0.2 mL细菌素与0.2 mL丁酸梭菌（肽肠健组）、0.2 mL噬菌体（噬菌体组）、0.2 mL肽肠健与0.2 mL噬菌体（肽噬组）、0.2 mL细菌素与0.2 mL噬菌体（细噬组）。第9天观察小鼠体重及发病情况，制作组织切片观察结肠病理变化，检测外周血常规及二胺氧化酶（DAO）含量，以及ELISA检测结肠组织中闭锁蛋白、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-10(IL-10)含量。结果显示：与DSS模型组相比，细菌素组、噬菌体组、肽噬组和细噬组体重均升高（P<0.01），肽肠健组差异不显著，试验各组结肠长度增加（P<0.01），损伤的结肠上层黏膜得以部分修复；与模型组2/3的小鼠血液中性粒细胞含量超标相比，...     

斑马鱼心脏的显微与超微结构

应用光镜和透射电镜对斑马鱼心脏的显微与超微结构进行了观察。结果显示,斑马鱼心脏由心室、心房、动脉球和静脉窦构成。心室呈棕红色,分层明显,分为心外膜区的致密层和心内膜区的海绵层。心房呈亮红色,仅由疏松的海绵层构成。心室的前方会发出一条动脉干(腹主动脉),动脉干的起始部膨大呈椭球状,称为动脉球。动脉球呈梨形,由内向外可分为内膜层、中间层和外膜层3层。静脉窦单独进行分离较难,因此未对静脉窦进行单独分离观察。本实验在心室、心房和动脉球中同时观察到telocyte间质细胞的存在,它们的形态瘦长,可分为细部和膨大部。在心室的心肌细胞内观察到多泡体的存在,它们常分布在心肌细胞的外缘,贴近肌纤维膜或者邻近心肌细胞外缘的线粒体。