小鼠感染肝片吸虫早期IL-4/IFN-γ及M2巨噬细胞标记分子的变化

为弄清肝片吸虫感染早期的主要细胞免疫类型及选择性激活巨噬细胞(M2或AAMΦ)标记分子的变化,本试验采用肝片吸虫囊蚴为感染源,经口分别感染雌性BALB/c野生型小鼠,运用特异性PCR鉴定成功感染小鼠后用间接ELISA对腹腔中IL-4和IFN-γ的水平进行测定,并对细胞因子IL-4、转录因子GATA3和M2的标记蛋白Relm a、Ym1分子的mRNA进行荧光定量PCR检测.结果显示,在感染后1,3,5,7周,从所获取肝脏组织中扩增的ITS2片段条带清晰,大小正确,测序后确定为肝片吸虫ITS2序列,表明肝片吸虫感染成功.对腹腔中IL-4和IFN-γ的水平测定表明感染组IL-4在感染后1,3,5周比对照组的显著增加(P=0.013,P＜0.01,P=0.02),但在第7周时无显著差异.IL-4的水平显著高于IFN-γ(P=0.011),而在第7周两者间无显著差异；对腹腔中IL-4、GATA3、Relm α和Ym1 mRNA水平的测定结果表明,感染后IL-4和GATA3 mRNA水平在第3周达到最高峰；于感染后1,3,5,7周,IL-4和GATA3 mRNA水平都分别显著高于对照组(IL4:P=0.01,P=0.012,P=0.023,P=0.014;GATA3:P=0.011,P＜0.01,P=0.032,P=0.014),但IL-4和GATA3间无显著差异；Relm α和Ym1mRNA水平都分别显著高于对照组(Relm α:P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01,P=0.011;Ym1:P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01,P=0.012),且二者间无显著差异,并随时间推移mRNA水平都呈下降趋势,于第7周达到最低水平.本研究成功利用肝片吸虫-小鼠模型研究蠕虫感染早期细胞免疫类型及M2标记分子的变化,发现在肝片吸虫感染小鼠早期主要引起Th2为主的细胞免疫.IL-4和M2巨噬细胞标记分子Relm α和Ym1在感染后1,3,5,7周都显著增加且具有相似的变化趋势,但nelmα和Ym1在第1周的高表达可能受诸多因素的影响还有待深入研究.     

IL-4对肝片吸虫感染诱导的巨噬细胞中脂肪酸结合蛋白2分布的影响

为阐明小鼠感染肝片吸虫后巨噬细胞中脂肪酸结合蛋白2(FABP2)的分布,采用肝片吸虫囊蚴为感染源,经口分别感染雌性BALB/c野生型(WT)及其IL-4单抗处置小鼠,在运用特异性PCR鉴定成功感染小鼠后获取巨噬细胞,并设立人工巯基醋酸盐诱导巨噬细胞对照组进行体外培养。用荧光定量PCR检测选择性激活巨噬细胞的标记蛋白Relmα、Ym1和 Arginase1以确定其激活状态。采用特异性抗体对所获取的巨噬细胞细胞质染色后用共聚焦显微镜摄取不同时间点从不同小鼠体内获取的巨噬细胞染色后的图片。野生型BALB/c巨噬细胞中Relmα、Ym1和Arginase1均大量表达;IL-4单抗处置BALB/c小鼠和巯基醋酸盐诱导小鼠中巨噬细胞中的Relmα、Ym1和Arginase1的表达量较野生型小鼠中的极显著或显著下降。FABP2在FeMΦ中并不分布于细胞质膜下,而是呈点状广泛分布于细胞质中,其荧光强度在12~24 h间呈上升趋势,在24~48 h间却呈下降趋势。     

IL-4受体阻断对小鼠急性感染肝片吸虫后肝脏单核细胞悬液中细胞因子的影响

本研究旨在探索肝片吸虫感染小鼠急性期肝脏单核细胞悬液中细胞因子表达模式及其原因。试验将小鼠分为4组,分别对感染抗体处置组、感染非抗体处置组、抗体处置非感染组和非抗体处置非感染组的肝脏单核细胞培养上清液中IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ进行测定;同时也对肝脏中IL-4及IL-12P40 mRNA水平进行荧光定量PCR检测。结果显示,IL-4和IL-5的表达模式相似。在非感染状态下,无论是否进行抗体处置,两者都处于较低表达水平。在感染状态下,两者在非抗体处置小鼠中的表达显著高于抗体处置组(P<0.05)。IL-13与IL-4及IL-5的表达差异在于感染并用抗体处置后,小鼠肝脏单核细胞中的IL-13仍有较高水平表达。IFN-γ的表达量在感染后有所增加,但在有无抗体处理间无显著差异(P>0.05)。mRNA检测结果显示,在非感染状态下,抗体处置后的IL-4 mRNA水平显著低于非抗体处置组(P<0.05)。感染后非抗体处置组小鼠中IL-4 mRNA水平极显著高于抗体处置组(P<0.01),同时也极显著高于非感染非抗体处置组(P<0.01)。IL-12P40 mRNA的水平在感染状态下,抗体处置组的IL-12P40 mRNA虽较非抗体处置组低,但无显著差异(P>0.05)。但感染后非抗体处置组的IL-12P40 mRNA水平均极显著高于感染组抗体处置和非抗体处置组(P<0.01)。本试验结果表明,IL-4Rα对肝片吸虫感染急性期IL-5和IL-4的表达极其重要,但对IL-13及IFN-γ的影响较小。     

犬恶丝虫硫氧还蛋白过氧化物酶真核表达质粒的构建及初步免疫试验

为评价犬恶丝虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)真核表达质粒的免疫原性,本实验利用RT-PCR方法扩增TPx基因,将其克隆于真核表达载体pVAX1中构建重组质粒pVAX1-TPx,并对其进行体外表达鉴定及通过特异性抗体水平及相关的免疫因子的检测,评价其在体内诱导的免疫反应.实验结果表明,将pVAX1-TPx转染于Cos7细胞中能够正确表达TPx,其分子量约为28 ku,并被阳性血清所识别.将pVAX1-TPx免疫BALB/c小鼠并采用ELISA检测结果显示,重组质粒免疫组的外周血中抗体、Th2细胞分泌的IL4及IL13细胞因子水平均显著高于空质粒及空白对照组(p＜0.05);但Th1分泌的IFN-γ及IL2水平差异不显著.此外,淋巴细胞增殖试验结果也表明,pVAX1-TPx免疫组显著高于其他两个对照组(p＜0.05).实验数据表明pVAX1-TPx免疫可以有效诱导特异性的体液和细胞免疫.