鲤浮肿病研究进展

鲤浮肿病(Carp edema virus disease,CEVD),也称锦鲤昏睡病(koi sleepy disease,KSD),是一种严重危害鲤和锦鲤养殖的病毒病。本文对鲤浮肿病的病原生物学特征、临床症状、易感品种、发病条件、传播方式、分布范围、分子流行病学、病毒检测方法、防控措施等,进行了阐述和介绍,旨在为该病的预防与控制提供参考。     

尖裸鲤实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选能够稳定表达的内参基因用于尖裸鲤Oxygymnocypris stewarti实时荧光定量PCR分析,以尖裸鲤血液、心脏、肝、脾、鳃、头肾、中肾、后肾、前肠、中肠、后肠、性腺、眼、垂体、脑、红肌、白肌和皮肤18个组织为材料,应用实时荧光定量PCR技术比较了GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)、HPRT1(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1)、RPL13(核糖体蛋白L13)、RPL19(核糖体蛋白L19)、RPL13a(核糖体蛋白L13a)、SDHA(琥珀酸脱氢酶亚基A)和ACTB(β-肌动蛋白)7个候选内参基因的表达情况,并采用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对7个候选内参基因的稳定性进行分析。结果表明:GeNorm分析显示,7个候选内参基因的平均表达稳定值(M)依次为RPL13=RPL13aRPL19GAPDHACTBSDHAHPRT1,其中RPL13和RPL13a的M值均最小(0.62);NormFinder分析显示,7个候选内参基因的M值依次为RPL13RPL13aRPL19GAPDHACTBSDHAHPRT1,其中RPL13的M值最小(0.30);BestKeeper分析显示,7个候选内参基因的标准差(S.D.)依次为RPL13RPL19GAPDHHPRT1RPL13aSDHAACTB,变异系数(CV)值依次为RPL13RPL19HPRT1GAPDHSDHARPL13aACTB,其中RPL13的标准差(0.84)和变异系数(4.54%)均最小;7个候选内参基因在尖裸鲤不同组织中的表达量存在差异。研究表明,7个内参基因中RPL13的表达较为稳定,可作为尖裸鲤实时荧光定量PCR分析的适宜内参基因,本研究结果可为尖裸鲤遗传学及分子生物学等研究提供基础数据。     

线粒体介导的三倍体虹鳟卵母细胞凋亡

采集不同发育时期三倍体虹鳟幼鱼卵巢,采用免疫组化、线粒体膜电位荧光探针、荧光定量PCR和蛋白免疫印迹等方法,观察、检测卵巢发育过程中卵母细胞细胞凋亡现象及线粒体凋亡途径,证实三倍体虹鳟卵母细胞发生线粒体介导的细胞凋亡。结果表明,12℃发育水温下,三倍体虹鳟卵母细胞在受精后210 d开始凋亡,受精后270 d凋亡达高峰,330 d凋亡逐渐消失。证明卵母细胞发生凋亡是导致三倍体雌性虹鳟不育的重要原因,为三倍体鱼类性腺发育深入研究提供理论依据。     

氨氮急性胁迫下二、三倍体雌性虹鳟应激耐受性比较

在集约化养殖条件下,当受到环境因子或人为因子胁迫时,三倍体雌性虹鳟死亡率明显高于二倍体雌性虹鳟,此现象与其应激耐受性有关.为了解氨氮急性胁迫下二倍体和三倍体雌性虹鳟应激耐受性差异,采用96 h半静态毒性试验法,在氨氮浓度分别为16.42、24.3、36.06 mg·L-1胁迫下,对二者急性毒性效应、血液生理生化指标以及肝脏非特异性免疫相关基因表达开展研究.结果表明,与二倍体雌性虹鳟相比,三倍体雌性虹鳟毒性反应较迅速且强烈,其血液中白细胞(WBC)、皮质醇(COR)和丙二醛(MDA)含量高;红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性低;鳃组织炎性细胞浸润,黏液细胞增多,鳃小片黏连,组织损伤严重;三倍体雌性虹鳟肝脏TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8基因表达量高于二倍体雌性虹鳟,HSP70、HSP90基因表达量低于二倍体雌性虹鳟.可知,三倍体雌性虹鳟对氨氮胁迫反应较二倍体雌性虹鳟更为敏感,其抗氧化及携氧调节能力较弱,即三倍体雌性虹鳟对氨氮急性胁迫应激耐受性更差.     

Nisin与山楂提取物复配的抑菌性能研究

[目的]为开发新型天然防腐剂提供依据。[方法]以山楂为材料，枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和大肠杆菌为供试菌种，采用传统水煎法提取山楂中的有效成分，并向10、2ID、30、40、50、60、70、80、90、100出提取物中分别加入10nagNisin制成复配物，测定复配物对3种供试菌的抑菌效果。[结果]Nisin的效价为994．5IU／mg，当山楂提取物加入量为50出时，效价达到1531IU／mg，为Nisin的1．53倍，但提取物加入量超过50出时，效价下降。复配物对3种供试茵的抑菌效果好于单独使用山楂提取物和Nisin。[结论]山楂提取物与Nisin的复配物时3种供试菌均有较好的抑制效果，且Nisin与山楂提取物的最佳复配比例为1：5（mg：μl）。     

传染性胰脏坏死病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

传染性胰脏坏死病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)是一种严重危害鲑鳟鱼类的重要传染性病原。为建立IPNV快速检测方法，根据IPNV VP2蛋白编码基因保守序列，设计并筛选出特异性引物和Taq Man探针，并优化筛选引物以及探针检测浓度、退火温度和退火时间，建立了一种实时荧光定量RT-PCR检测方法，并对方法进行了评价。结果显示：该方法灵敏度高，对IPNV的检测限为5 copies/μL；特异性强，对传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、病毒性出血性败血症病毒、草鱼呼肠孤病毒、流行性造血器官坏死病毒等其他病毒核酸扩增均呈阴性；重复性良好，组内与组间重复平均变异系数均小于3%；用本研究建立的实时荧光定量RT-PCR方法，对40份经病毒分离鉴定的样品进行IPNV检测，符合率为100%。结果表明，本研究建立的方法具有快速、特异、敏感等优点，可检测病毒含量较低的组织样品，对于IPNV的快速检测更具优势。     

感染鲤浮肿病毒镜鲤的组织病理变化及病毒分布规律研究

【目的】 研究感染鲤浮肿病毒（Carp edema virus，CEV）镜鲤的组织病理特征及CEV在各组织中的分布规律，以期为鲤浮肿病的诊断和防控提供参考。【方法】 利用HE染色观察发病镜鲤心脏、肝脏、皮肤、脾脏、肾脏、脑、鳃组织的病理变化情况；用免疫组织化学法检测CEV在镜鲤各组织的分布和蛋白表达情况；利用CEV P4a基因保守区域设计3条探针，于5'-端标记FAM进行原位杂交，检测CEV在镜鲤各组织的核酸分布情况；实时荧光定量PCR检测感染镜鲤各组织的病毒载量。【结果】 HE染色观察发现，患病镜鲤的鳃丝肿胀、充血，鳃丝间有脱落堆积的红细胞和炎性细胞，肝脏细胞深染萎缩，胆小管出血，脾脏组织出现明显间隙并伴有出血，肾脏组织充血明显，肾小管有明显闭合现象。免疫组织化学结果显示，在患病鱼的鳃和肝脏组织中大量表达CEV P4a蛋白，在其他组织中也有少量表达。原位杂交结果显示，CEV核酸大量存在于鳃组织中，在心脏、脾脏和肾脏中均有少量阳性信号。实时荧光定量PCR结果显示，鳃组织病毒载量极显著高于心脏、肝脏、皮肤、脾脏、肾脏、脑组织（P<0.01）。【结论】 感染CEV后，镜鲤内脏组织出现不同程度充血、出血，病毒主要分布在鳃，说明鳃是CEV增殖的最主要靶器官。