凡纳滨对虾精氨酸激酶的分离纯化及性质研究

经过CM-纤维素批量层析、Separdex G-100柱层析、DEAE_纤维素柱层析等步骤,从凡纳滨对虾肌肉组织分离得到精氨酸激酶,经SDS-PAGE检测达到电泳纯,分子量约为40kDa.对该酶的性质进行分析结果表明,精氨酸激酶的最适作用温度为55℃,当温度高于65℃时,酶活力显著下降;pH 8时酶活力较高,低浓度的精氨酸对酶活力有促进作用,高浓度时表现抑制作用,而底物类似物精胺和氨基胍则对酶促反应表现出完全的抑制.NaCl,KCl对酶的活力具有促进作用,低浓度(10 mmol·L-1)MgCl2对酶活力表现出激活作用,而CuCl2与MnCl2则表现出完全抑制酶活力,CaCl2与ZnCl2在低浓度时对酶活力无明显影响,但是随着浓度升高,对酶具有抑制作用.     

凡纳滨对虾精氨酸激酶的多克隆抗体制备及组织特异性表达分析

精氨酸激酶（arginine kinase，AK）在调节无脊椎动物磷酸精氨酸与ATP之间能量平衡的过程中具有重要作用。在前期工作基础上，设计特异引物，以凡纳滨对虾肌肉组织cDNA为模版，克隆得到了1 071 bp的凡纳滨对虾精氨酸激酶的完整开放阅读框；将它克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上，转化BL21 (DE3) 菌株，经诱导后表达出GST-AK融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫小鼠，制备多克隆抗血清，经检测该抗原与抗体识别良好。利用得到的抗体对凡纳滨对虾AK在蛋白质水平上的特异性表达进行分析发现，精氨酸激酶在对虾的肌肉、心脏、神经、血细胞和胃组织中具有高的表达量，而在眼柄、肝胰腺、鳃和皮肤组织中表达量较低。为进一步研究精氨酸激酶在对虾体内的功能奠定了基础。     

鲤基因组中1个新Tc1类转座子的发现与鉴定

在鲤(Cyprinus carpio)基因组中鉴别出一个新的具有潜在转座活性的Tc1类转座子,并命名为CCTN转座子(Cyprinus carpio Transposon,CCTN)。CCTN转座子全长1 611 bp,由两端约214 bp的反向重复序列(Inverted Repeat,IR)和中间不间断的996 bp的转座酶开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)组成。CCTN转座子推测的转座酶序列中存在完整的DD(34)E结构域,此结构域是Tc1类转座酶作用的必需位点之一。采用实时荧光定量PCR评估CCTN转座子在鲤基因组中的拷贝数约为2.28×103,占全基因组的0.21%。分子系统学研究表明,CCTN转座子是一个新的鱼类Tc1类转座子,其与斑马鱼(Danio rerio)Tzf-28、大西洋鲑(Salmo salar)SALT1和鲽(Pleuronectes platessa)PPTN2等Tc1类转座子亲缘关系较近。     

鲤基因组中1个新Tcl类转座子的发现与鉴定

在鲤(Cyprinus carpio)基因组中鉴别出一个新的具有潜在转座活性的Tcl类转座子,并命名为CCTN转座子(Cyprinus carpio Transposon,CCTN).CCTN转座子全长l 611 bp,由两端约214 bp的反向重复序列(Inverted Repeat,IR)和中间不间断的996 bp的转座酶开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)组成.CCTN转座子推测的转座酶序列中存在完整的DD(34)E结构域,此结构域是Tel类转座酶作用的必需位点之一.采用实时荧光定量PCR评估CCTN转座子在鲤基因组中的拷贝数约为2.28×103,占全基因组的0.21％.分子系统学研究表明,CCTN转座子是一个新的鱼类Tcl类转座子,其与斑马鱼(Danio rerio)Tzf-28、大西洋鲑(Salmo salar)SALT1和鲽(Pleuronectes platessa)PPTN2等Tcl类转座子亲缘关系较近.     

鲤CC型趋化因子CCL-C5a样基因的克隆、组织表达与进化分析

趋化因子家族是一类能诱导白细胞激活和迁移的趋化性细胞因子家族,是鱼类先天免疫的重要组成部分.CC类家族是趋化因子家族中最大的家族之一.为研究鲤CC类家族成员的组织表达和进化模式,以及进一步研究鲤CC类趋化因子的免疫调控机制,本研究选择该家族其中的一个基因,CCL-C5a样基因,根据EST序列结合RACE方法从鲤(Cyprinus carpio)脾脏中克降了该基因的全长cDNA序列(GenBank登录号:JQ026408).该序列全长830 bp,5端非翻译区174 bp,3端非翻译区296 bp,开放阅读框360 bp,编码一个由119个氨基酸组成的蛋白.结构域分析发现,该蛋白质含有分泌信弓肽和保守的趋化因子结构域;Gene Ontology注释该基因参与免疫细胞迁移的生物学过程.CCL-C5a基因在鲤10个组织中表达,其中在脾和肝的表达量最高.脂多糖刺激鲤外周血白细胞和头肾白细胞后,该基因表达量出现显著上升.氨基酸序列保守性分析表明,鲤CCL-C5a样趋化因子与斑马鱼(Danio rerio)的同源性最高,为61％,与蓝鲶(Ictalurus futrcatus)、沟鲶(Ictalurusp unctatus)和大西洋鲑(Salmo salar)的同源性分别为47％、47％和42％;与人(Homo sapiens)CCL19蛋白的同源性为37％.适应性进化分析发现,鲤与斑马鱼CCL-C5a的Ka/Ks小于1,说明CCL-C5a基因在鱼类的进化过程受到负选择压作用.本研究结果表明,鲤CCL-C5a主要在免疫器官上高表达,并受到脂多糖诱导表达上升;同时该基因在鱼类中受到负选择作用.这些结果提示CCL-C5a可能是一个与免疫相关的基因.