鲤鱼肝原代细胞的分离与培养方法

本研究在酶消化法的基础上,通过比较不同的肝组织分离和培养条件,获得鲤鱼肝原代细胞培养的最佳培养方法和条件。首先,结合细胞数量和台盼蓝染色所得的细胞存活率,比较了胰蛋白酶消化鲤鱼肝组织的不同反应温度和时间,结果表明:肝组织用0.25%(m/V)胰蛋白酶在25℃消化40 min时细胞分离效果最好。其次,经酶消化得到的肝原代细胞粗制液,设置4种不同的细胞纯化和培养条件:1)将细胞直接重悬于含10%胚牛血清(FBS)的L-15/DMEM培养基中培养;2)以10%鲤鱼血清取代培养基中的胚牛血清重悬细胞并培养;3)将细胞经Percoll液密度梯度离心纯化后,重悬于含10%胚牛血清的L-15/DMEM培养基中培养;4)细胞经Percoll纯化后,重悬于含10%鲤鱼血清的L-15/DMEM培养基中培养。利用光学显微镜观察肝细胞的形态,进而通过HE染色法检测,结果表明经Percoll纯化后,肝细胞纯度显著提高;采用MTS/PMS法检测肝细胞的增殖情况,结果表明鲤鱼血清代替胚牛血清培养细胞,肝细胞活力显著提高。本研究将为建立稳定的毒理学肝原代细胞实验模型奠定基础。