无乳链球菌dnaJ基因缺失株的构建及其致病性研究

为研究dnaJ基因序列与细菌致病力的关系,本研究构建了dnaJ基因缺失株和互补株,并对其致病性进行验证。参照GenBank中无乳链球菌GD201008-001(登录号:NC_018646)目的基因序列分别设计引物,PCR克隆dnaJ基因上、下游同源臂基因序列,通过融合PCR将两个片段连接到一起,构建dnaJ基因上、下游同源臂融合片段,PCR克隆含有启动子序列的dnaJ基因。将dnaJ基因上、下游同源臂融合片段和含有启动子序列的dnaJ基因分别连接链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET4s和pSET2,电转化GD201008-001感受态细胞,构建dnaJ基因缺失株ΔdnaJ和互补株CΔdnaJ。通过分析ΔdnaJ和CΔdnaJ的遗传稳定性与形态学变化对dnaJ上、下游基因转录的影响,以及生长速率和斑马鱼攻毒试验评价dnaJ基因对无乳链球菌毒力的影响。经PCR鉴定和测序证明,ΔdnaJ和CΔdnaJ构建成功;与野生株GD201008-001相比,ΔdnaJ和CΔdnaJ在细菌染色形态上均无明显差异,但ΔdnaJ在液体培养基中的生长速度明显减缓;dnaJ基因的缺失未对相邻基因的转录造成影响;ΔdnaJ对斑马鱼的毒力明显下降,对斑马鱼的LD_(50)为5.68×10~4 CFU,约是野生株的241倍。dnaJ基因对无乳链球菌的毒力有显著影响,本试验结果为进一步探究无乳链球菌dnaJ基因的功能提供了参考依据。     

应用iTRAQ定量蛋白质组学技术筛选无乳链球菌鱼源株与人源株差异表达蛋白

以斑马鱼和巨噬细胞作为体内、外感染模型,比较无乳链球菌鱼源株GD201008-001与人源株A909的致病性差异,利用iTRAQ技术和质谱分析技术进行差异表达蛋白鉴定,以期为揭示无乳链球菌不同宿主来源株致病机制提供新思路。实验通过测定菌株GD201008-001、A909的斑马鱼半数致死量和巨噬细胞吞噬率,比较二者致病性差异;提取全菌蛋白,经iTRAQ试剂标记后进行质谱鉴定,质谱数据用软件Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4进行查库(Uni Prot数据库)鉴定及定量分析,并对差异蛋白进行GO功能注释和KEGG通路分析。结果显示,GD201008-001毒力显著高于A909;通过iTRAQ分析两株菌差异表达蛋白,发现差异蛋白涉及的生物学功能较为广泛,在鉴定出的368个差异表达蛋白中,GD201008-001中上调表达蛋白193个(比值1.5),下调表达蛋白175个(比值0.667)。生物信息学分析预测这些蛋白主要涉及26个生物学功能,14个通路,推测Clp X、Glm S和Cps IVK可能在两株菌致病性差异中发挥重要作用。本研究为阐明无乳链球菌不同宿主来源株致病性差异奠定了基础。     

EDTA对鸭疫里氏杆菌外膜蛋白表达及免疫原性的影响

用加入金属离子螯合剂EDTA的TSB(胰酪胨大豆肉汤)培养基,培养鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)Ⅰ型,将未加入EDTA的TSB培养的RAⅠ型菌株作对照。比较后发现,加入EDTA组的外膜蛋白(OMPs)的SDS-PAGE图谱发生改变,从34 ku~100 ku增加了多条蛋白条带,特别是39 ku,60 ku和110 ku蛋白浓度较大。电泳胶经Western-blot(康复血清作为一抗,自制酶标兔抗鸭为二抗),与对照组相比,实验组增加了39 ku条带。实验证明,加入金属离子螯合剂EDTA对外膜蛋白的表达和免疫原性均有影响。     

无乳链球菌dnaJ基因缺失株的构建及其致病性研究

为研究dnaJ基因序列与细菌致病力的关系,本研究构建了dnaJ基因缺失株和互补株,并对其致病性进行验证。参照GenBank中无乳链球菌GD201008-001（登录号：NC_018646）目的基因序列分别设计引物,PCR克隆dnaJ基因上、下游同源臂基因序列,通过融合PCR将两个片段连接到一起,构建dnaJ基因上、下游同源臂融合片段,PCR克隆含有启动子序列的dnaJ基因。将dnaJ基因上、下游同源臂融合片段和含有启动子序列的dnaJ基因分别连接链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET4s和pSET2,电转化GD201008-001感受态细胞,构建dnaJ基因缺失株ΔdnaJ和互补株CΔdnaJ。通过分析ΔdnaJ和CΔdnaJ的遗传稳定性与形态学变化对dnaJ上、下游基因转录的影响,以及生长速率和斑马鱼攻毒试验评价dnaJ基因对无乳链球菌毒力的影响。经PCR鉴定和测序证明,ΔdnaJ和CΔdnaJ构建成功;与野生株GD201008-001相比,ΔdnaJ和CΔdnaJ在细菌染色形态上均无明显差异,但ΔdnaJ在液体培养基中的生长速度明显减缓;dnaJ基因的缺失未对相邻基因的转录造成影响;ΔdnaJ对斑马鱼的毒力明显下降,对斑马鱼的LD₅₀为5.68×10⁴ CFU,约是野生株的241倍。dnaJ基因对无乳链球菌的毒力有显著影响,本试验结果为进一步探究无乳链球菌dnaJ基因的功能提供了参考依据。     

2017年冬季上海地区犬流感病毒的检测与HA、NA序列的遗传进化分析

为了解2017年冬季上海临床接诊犬的流感病毒感染情况和病毒变异趋势,收集上海某动物医院疑似犬流感样品进行RT-PCR检测,构建HA、NA的重组载体并测序,对获得的序列进行进化分析、氨基酸变异分析,综合我国同亚型犬流感病毒HA序列进行进化率分析。结果显示:23份疑似样品中检出5份阳性样品,获得5个H3亚型的HA序列、2个N2亚型的NA序列,上述序列在进化树中已经形成独立的进化分支,与韩国、广东毒株亲缘关系最近;氨基酸比对表明,HA和NA在重要位点发生许多一致的突变,如抗原位点区域、糖基化位点等,NA茎部未见氨基酸插入;对2007年至2017年中国南方地区分离的H3N2犬流感病毒HA片段进行进化率、变异率分析显示,年平均进化率呈逐年增高趋势,变异不断积累。研究表明,开展犬流感病毒变异监测,掌握病毒变异和进化方向,对防控该病、防止病毒向人群传播有重要意义。