无乳链球菌GD201008-001二元调控系统RscSR的鉴定及其对细菌应激适应性和毒力特性的影响

为鉴定鱼源无乳链球菌GD201008-001二元调控系统(two-component system, TCS)RscSR并探究其功能,实验利用生物信息学方法预测到可能的RscSR,对其组成成分RscS和RscR的三维结构和保守结构域进行分析;构建基因缺失株ΔrscSR与互补株CΔrscSR,测定细菌的生长曲线,检测其耐酸应激、耐氧化应激、抗巨噬细胞吞噬和胞内存活能力,同时测定其对巨噬细胞的毒性和对小鼠的毒力。结果显示,RscSR具有典型的TCS结构特点,其中RscS具有组氨酸激酶结构域,RscR具有反应调节子结构;其编码基因缺失后,菌株耐酸、耐氧化、抗巨噬细胞吞噬和胞内存活能力及对巨噬细胞毒性均显著降低,而将该基因回补后各项能力均有所恢复;动物实验结果显示,野生株感染小鼠19 h内全部死亡,而ΔrscSR缺失株感染小鼠全部死亡时间为48 h。研究表明,RscSR在无乳链球菌应激适应性以及毒力方面发挥重要作用。     

吉富罗非鱼感染无乳链球菌后肝脏组织在不同时期蛋白质组的表达差异

为研究罗非鱼感染无乳链球菌前后肝脏组织蛋白质的表达变化。本研究以吉富罗非鱼为材料,采用双向电泳技术分析其在无乳链球菌感染胁迫下24 h、48-144 h、12 d与对照组（未感染）肝脏组织蛋白质组的变化,对差异表达蛋白进行质谱分析鉴定。结果显示：吉富罗非鱼在无乳链球菌胁迫下,3个实验组的蛋白质图谱与对照组相比存在显著差异,共有30个蛋白点发生显著改变,其中13个表达上调,17个下调,2个下调蛋白点在感染12 d组消失。通过MALDI-TOF-MS MS/MS质谱分析和数据库检索对这些蛋白质进行了功能分类,发现它们涉及到能量代谢、细胞防御与应激、消化免疫、抗氧化与排毒等许多方面。推测这些蛋白可能在吉富罗非鱼对无乳链球菌胁迫的抗性反应中发挥了重要作用。研究结果为无乳链球菌疫苗的研制及吉富罗非鱼抗病品种选育奠定了基础。     

中国七种水生动物源无乳链球菌的分子特征及其对斑马鱼的致病性

为了解中国水生动物源无乳链球菌的分子流行特征,揭示其传播和流行规律,本实验对分离得到并鉴定的10株7种水生动物源无乳链球菌通过分子血清型、多位点序列分型(MLST)分型、毒力基因型和前噬菌体分型等方法进行分子分型;其次,通过斑马鱼评价7种水生动物源无乳链球菌的致病性。分子血清型分析结果表明,10株无乳链球菌可分为3种血清型,即Ⅰa、Ⅰb和Ⅲ型;MLST分型结果表明,Ⅰa型无乳链球菌均为ST7型,Ⅰb无乳链球菌均是ST261型,只有Ⅲ型无乳链球菌是ST739型。进一步分型结果表明,10株无乳链球菌可分为3种毒力基因型和4种前噬菌体基因型。根据4种分型结果可知,10株水生动物源无乳链球菌可分为4种类型,其中虎纹蛙源无乳链球菌具有独立的分子血清型、MLST型、毒力基因型和前噬菌体基因型,即Ⅲ-ST739-V1-P3;罗非鱼源无乳链球菌的基因型有3种,即Ⅰa-ST7-V2-P1、Ⅰa-ST7-V2-P2和Ⅰa-ST7-V3-P4;红尾皇冠鱼、鳙和罗非鱼源无乳链球菌的基因型相同:Ⅰa-ST7-V2-P2;卵形鲳鲹、宝石鲈和罗非鱼源无乳链球菌具有相同的基因型:Ⅰa-ST7-V2-P1;鲮和罗非鱼源无乳链球菌的基因型相同,即Ⅰb-ST261-V3-P4。致病性研究表明,7种水生动物源无乳链球菌对斑马鱼均有强致病性。研究表明,两栖类虎纹蛙源无乳链球菌和鱼源无乳链球菌的基因型明显不同,它们之间遗传变异较大,因此,无乳链球菌在两栖类和鱼类之间相互传播的可能性较小。鱼源无乳链球菌有3种基因型,且这3种基因型均在罗非鱼中流行,这表明无乳链球菌在鱼类中相互传播的可能性较大,尤其是在罗非鱼与其他鱼类之间。     

弗氏柠檬酸杆菌感染诱导斑马鱼皮肤免疫相关基因的差异表达

从草鱼肠道中分离到1株细菌,通过形态学观察、生理生化特征和16S rDNA序列分析等鉴定为弗氏柠檬酸杆菌,动物试验结果表明,该菌对斑马鱼有致病性;从感染诱导的斑马鱼皮肤组织中提取总RNA,经Biotin荧光标记与拥有15 617个cDNA片段的斑马鱼基因芯片(affymetrix)杂交筛选分析,获得斑马鱼皮肤免疫相关差异表达基因88个,其中有74个上调表达基因和14个下调表达基因;进一步根据基因功能聚类(GO)分析,初步将88个差异表达基因分为8个生物学功能,其中主要参与补体激活、急性期反应、应激防御反应、细胞凋亡、抗原加工提呈、细胞迁移粘附、凝血因子和血小板激活等免疫应答过程;同时进行信号通路(pathway)分析,结果表明MAPK(hsp70、daxx、nfkbiab)、JAK/STAT(ifn1)和TGF-β(thbs1)等信号通路参与斑马鱼皮肤抗弗氏柠檬酸杆菌感染免疫应答。采用基因芯片方法筛选与鱼类皮肤免疫相关的功能基因,为将来以斑马鱼为模型研究鱼类皮肤局部免疫应答的分子机制提供科学依据。     

吉富罗非鱼家系构建及抗病力检测

文章以吉富罗非鱼（GIFTstrainOreochromisniloticus）为研究对象,按照1雄配1雌原则进行家系配对,待家系鱼生长至50～60g·尾“时人工感染无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）（菌株GD001）。通过对GD001菌株半数致死浓度测定及各家系感染死亡率的统计,研究了GD001无乳链球菌感染对各家系吉富罗非鱼抗病力的影响。结果表明,1）配对成功家系67个,经繁殖性能筛选后留种53个,家系留种率为79．1％;2）GD001菌株的半数致死浓度为4×108cfu·mL－1,感染后2～6d为死亡高峰期;3）GD001菌感染53个家系后有11个家系的成活率在90％以上,15个家系的成活率在70％～89％,19个家系的成活率在30％～69％,8个家系的成活率低于30％,表明不同家系对GD001菌株的抗病力存在着显著的差异（P〈0．05）。     

西伯利亚鲟停乳链球菌的分离、鉴定与致病性

从患暴发性流行病的两伯利亚鲟(Acipenser baerii)肝脏和心脏中各分离到1株细菌,分离纯化后获得2个分离株,编号分别为AeBF070904、AbHT070912,对分离菌进行了菌株鉴定、致病性分析及药敏实验.分别应用常规生理生化鉴定、全自动细菌测定卡API 20 STREP和ID 32STREP进行检测,结果表明,2个分离株均为停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae).对2个分离株的16S rRNA基因进行PCR扩增和测序,并与GenBank中收录的链球菌16S rRNA基因进行序列分析并构建系统进化树,结果显示,2个分离株的16S rRNA基因序列相同,与停乳链球菌同源性最高达97.3%,在系统进化树上与停乳链球菌聚为一簇,进一步确认2个分离株均为停乳链球菌.从人工感染后发病鱼的内脏组织再分离的细菌特性与原感染菌相同,确认停乳链球菌是西伯利亚鲟的致病菌.2个分离株对两伯利亚鲟、杂交鲟及剑尾鱼均有致死毒性,37℃培养的细菌毒力比28℃培养的细菌毒力强.2个分离株均对青霉素、诺氟沙星等7种药物敏感;对头孢唑啉、庆大霉素等2种药物耐受;对红霉素巾等敏感;对卡那霉素等8种药物菌株之间出现差异.     

草金鱼感染拟态弧菌后脾脏和肠黏膜组织的差异蛋白组学

为探讨鱼类感染拟态弧菌后脾脏和肠黏膜组织蛋白差异变化,本研究以拟态弧菌04-14分离株人工感染实验动物草金鱼,利用双向电泳(2-DE)结合质谱技术对感染前后脾脏和肠黏膜组织的差异蛋白组学进行研究。结果显示,感染后脾脏和肠黏膜组织中分别有11个和12个显著差异表达蛋白点,经MALDI-TOF-MS质谱鉴定出19种显著差异表达蛋白,其中上调表达蛋白10种,下调表达蛋白9种,α-淀粉酶、载脂蛋白A-I、β-肌动蛋白和过氧化物还原酶2为两种组织中共同存在的显著差异表达蛋白。GO注释分析表明,显著差异表达蛋白分别定位于细胞外区、细胞质、线粒体和内质网,具有结合、转运、催化、免疫、抗氧化和细胞骨架等分子功能,参与物质与能量代谢、细胞膜转运、补体活化、应激反应、细胞与膜骨架组建、蛋白质折叠、氧化还原及铁离子运输等8个生物学过程。研究结果为进一步研究拟态弧菌的致病机制及其与宿主互作机制奠定了基础。     

白斑狗鱼(Esox lucius)致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定

近些年来,新疆许多养殖场发生白斑狗鱼暴发性疾病而死亡。为鉴定病因,本研究对乌鲁木齐周边地区的自然患病白斑狗鱼(Esox lucius)的肝脏、肾脏等组织进行分离,经形态观察、生理生化试验、16S r DNA序列分析进行细菌鉴定。并通过人工回归感染白斑狗鱼和鲫,来验证分离菌株的致病性。结果表明,分离出的9株优势菌为致病性嗜水气单胞菌,命名为PK001-PK009。经PCR特异性检测发现,所得的9个菌株分别含有丝氨酸蛋白酶基因(ahp A)、溶血素基因(hly A)和气溶素基因(aer A)中的0-3个,从而导致了菌株间致病性的差异。通过人工回归感染实验发现,白斑狗鱼患病症状与自然病例相似,并重新分离得到原感染菌,经细菌学鉴定,其性状与原菌株一致,为嗜水气单胞菌。     

白斑狗鱼(Esox lucius)致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定

近些年来,新疆许多养殖场发生白斑狗鱼暴发性疾病而死亡。为鉴定病因,本研究对乌鲁木齐周边地区的自然患病白斑狗鱼(Esox lucius)的肝脏、肾脏等组织进行分离,经形态观察、生理生化试验、16S r DNA序列分析进行细菌鉴定。并通过人工回归感染白斑狗鱼和鲫,来验证分离菌株的致病性。结果表明,分离出的9株优势菌为致病性嗜水气单胞菌,命名为PK001-PK009。经PCR特异性检测发现,所得的9个菌株分别含有丝氨酸蛋白酶基因(ahp A)、溶血素基因(hly A)和气溶素基因(aer A)中的0-3个,从而导致了菌株间致病性的差异。通过人工回归感染实验发现,白斑狗鱼患病症状与自然病例相似,并重新分离得到原感染菌,经细菌学鉴定,其性状与原菌株一致,为嗜水气单胞菌。     

广西罗非鱼链球菌病流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析

为获知近年广西罗非鱼链球菌病流行菌种及其基因型变化信息,采用特异PCR方法对2006-2012年从广西发病罗非鱼分离获得的77株临床菌株进行鉴定,并通过脉冲电场凝胶电泳(PFGE)对2006-2011年分离获得的37株流行菌株进行基因型分析.结果显示,其中20株鉴定为海豚链球菌其余57株鉴定为无乳链球菌.2006-2007年获得的19株流行菌株中有18株为海豚链球菌(94.7％),仅1株无乳链球菌;2009-2012年分离的58株流行菌株中56株为无乳链球菌(96.6％),仅2株海豚链球菌.PFGE图谱聚类显示,海豚和无乳链球菌分别聚类为两个大分支,20株海豚链球菌共产生4种PFGE带型,带型相似度为83.9％～100％;17株无乳链球菌共产生5种PFGE带型,带型相似度为47.4％～100％.研究表明,广西罗非鱼链球菌病流行菌种已从过去(2008年前)以海豚链球菌为主转变为现在(2009-2012年)以无乳链球菌为主;流行菌株PFGE基因型存在多样性.     

一株斑点叉尾致病菌的分离鉴定

从斑点叉尾(Ictalurus punctatus)肝脏分离到的一株细菌GD091027,对该菌进行人工感染试验、生理生化特性测定和16S rRNA序列测定并构建系统发育树,同时进行了抗菌药物敏感性试验。结果显示:当人工感染剂量大于1.0×107 CFU/尾时,能引起斑点叉尾100%发病死亡,对斑点叉尾的LD50为6.2×104 CFU/g。分离株GD091027为革兰氏阴性短杆菌,氧化酶阴性,在25℃、35℃均有运动性,能耐3%的NaCl,不发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、D-甘露醇及L-阿拉伯糖,不利用西蒙氏柠檬酸盐,不利用丙二酸,赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶阳性,产生硫化氢和吲哚,甲基红(MR)试验阴性。在16S rRNA系统发育树中,该菌与迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)聚为一分支。分离株GD091027对氨苄西林、庆大霉素、妥布霉素等16种抗菌药物敏感,利福平、青霉素等3种抗菌药物不敏感。除不产生溶血、不发酵葡萄糖和麦芽糖、甲基红(MR)试验阴性外,病原菌形态及生理生化特征符合迟缓爱德华氏菌,结合16S rRNA序列分析结果将其鉴定为迟缓爱德华氏菌。     

iTRAQ‐based identification of differentially expressed proteins related to growth in the swimming crab,Portunus trituberculatus

The swimming crab, Portunus trituberculatus, is an important farmed species in China, and it has been studied extensively, which requires more information on its genetic background. To date, information on the proteomics of P. trituberculatus is scarce. In this study, we used isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ)‐based proteomics to investigate growth regulation in P. trituberculatus. Total proteins were isolated from five tissues (eyestalk, gill, heart, hepatopancreas and muscle). Equal quantities of protein from each tissue were pooled at the proteome level using the iTRAQ method. A total of 961 proteins were identified using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry and de novo sequencing data. Using a 1.2‐fold change in expression as a physiologically significant benchmark, 30 differentially expressed proteins (DEPs) were found to undergo differential expression related to the growth of P. trituberculatus, and most of the growth‐related proteins, including those involved in metabolism, immune responses, DNA duplication and protein synthesis, were upregulated, indicating that conservation of energy is an important strategy to cope with growth. There was a high consistency between the expression levels determined using iTRAQ and mRNA, highlighting the high reproducibility of our proteomic approach and its great value in elucidating the molecular mechanisms of P. trituberculatus.     

一株从草鱼中分离的嗜水气单胞菌的病原学及基因组特征

为确定南昌地区某渔场草鱼出血性败血症的病原体及病原特征，从患病草鱼的肝脏病灶中分离出一株致病菌A1310。对分离菌进行了形态特征、理化特性等表型生物学检验、人工感染实验及对抗菌药物的敏感性实验，并对其进行了全基因组测序、基于多序列位点分型(multilocus sequence typing，MLST)的系统进化分析及毒力基因分析。结果显示，生理生化鉴定证明该菌为嗜水气单胞菌，当浓度达1.0×10⁶ CFU/mL时，对草鱼有致病性；对供试20种抗菌药物中的青霉素等7种耐药，对卡那霉素等5种敏感；A1310株基因组框架序列共包含96个与毒力和防御相关基因，其中多药耐药性外排泵基因占大多数，约为22%；与美国斑点叉尾鮰分离株(S15-242、S15-458、S15-591、S15-700)聚类为同一进化分支；比较基因组分析发现，A1310具有一个删减版的Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system，T6SS)，基因数量为标准Ⅵ型分泌系统的80%，缺少vgrG和vca0109基因的部分片段。综上所述，来源于草鱼的嗜水气单胞菌菌株A1310，与美国斑点叉尾鮰分离株具有亲缘关系，含有多个已报道的嗜水气单胞菌的毒力基因。本研究不仅丰富了嗜水气单胞菌的生物学性状内容，也为嗜水气单胞菌的有效检验、防治和深入研究提供一定的参考，对草鱼的疾病防控具有一定意义。     

剑尾鱼RW-H近交系的遗传结构分析

筛选31条随机引物对剑尾鱼的第8代近交RW-H系A、B、C3窝共11尾剑尾鱼个体基因组DNA进行RAPD扩增，计算近交系个体间及不同窝间的相似系数及遗传距离。结果筛选的31条引物共扩增出383条带，扩增片段的大小在0．2～3kb。其中多态性带30条，多态性带频率在0～58．33％，平均为7．83％。近交系剑尾鱼不同个体拥有相同条带的比率较高。计算得到近交系的平均相似系数(S)为0．9829(0．9716～0．9960)，平均等位基因频率(q)为0．8692，最低平均杂合率(H)为0．1308。同时，用5个微卫星标记对非选育剑尾鱼和近交系RW-H系的基因组进行分析，检测等位基因的个数和大小，结果5个微卫星座位在非选育剑尾鱼中显示为多态，而在近交系RW-H系除1个位点出现等位基因外，其余均为纯合子，计算得到近交系的平均遗传相似系数为0．9345，两种方法均证明近交RW-H系第8代剑尾鱼有较高的遗传纯合度。     

16SrDNA序列分析鉴定一株合浦珠母贝共附生乳酸菌

从合浦珠母贝（Pinctada fucata）粘液中分离纯化得到一株抗菌物质产生菌F9,利用16SrDNA方法鉴定该菌株为棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）。通过琼脂扩散法测定了该菌的抑菌谱,发现该菌发酵液上清液在排除有机酸和过氧化氢（H2O2）的影响后仍对金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）等多种食源性致病菌有明显的抑菌作用。对该菌发酵液抑菌物质进行超滤分析及蛋白酶处理,可推断该抗菌物质为分子量在5～10kDa的蛋白类物质。     

Capsular polysaccharide of Streptococcus agalactiae is an essential virulence factor for infection in Nile tilapia (Oreochromis niloticus Linn.)

Streptococcus agalactiae (Group B Streptococcus, GBS) is associated with diverse diseases in aquatic animals. The capsule polysaccharide (CPS) encoded by the cps gene cluster is the major virulence factor of S. agalactiae; however, limited information is available regarding the pathogenic role of the CPS of serotype Ia piscine GBS strains in fish. Here, a non‐encapsulated mutant (Δcps) was constructed by insertional mutagenesis of the cps gene cluster. Mutant pathogenicity was evaluated in vitro based on the killing of whole blood from tilapia, in vivo infections, measuring mutant survival in tilapia spleen tissues and pathological analysis. Compared to wild‐type (WT) GBS strain, the Δcps mutant had lower resistance to fresh tilapia whole blood in vitro (p < 0.01), and more easily cleared in tilapia spleen tissue, and was highly attenuated in tilapia and zebrafish. Additionally, compared to the Δcps mutant, numerous GBS strains and severe tissue necrosis were observed in the tilapia spleen tissue infected with WT strains. These results indicated that the CPS is essential for GBS pathogenicity and may serve as a target for attenuation in vaccine development. Gaining a better understanding of the role, the GBS pathogenicity in fish will provide insight into related pathogenesis and host–pathogen interactions.     

杂色鲍肌肉萎缩症病原菌的分离鉴定及系统发育分析

近几年中国南方杂色鲍（Haliotis diversicolorReeve）养殖场频繁爆发严重的肌肉萎缩症,该病能感染各种规格杂色鲍,死亡率很高。病鲍症状主要表现为外套膜和内脏团萎缩、无生气,附着力下降,最终死亡。该试验从病鲍组织分离到1株优势菌WS,人工感染试验证实其对健康杂色鲍有很强致病性,且与自然发病的杂色鲍症状相同。对菌株WS进行形态学观察和生理生化检测,结果显示与哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）最为接近。为了进一步确定其分类地位,采用1对通用引物扩增其16S rDNA序列片断进行序列分析和同源性对比,构建系统发育树,结果表明,菌株WS与弧菌属的V.harveyi[AY750577]聚为1个分支,且同源性达99.70%。综合上述3种鉴定结果,确定该菌为哈维氏弧菌。     

Comparative proteomic analysis of virulent and rifampicin-attenuated Flavobacterium psychrophilum

Flavobacterium psychrophilum is the aetiologic agent of bacterial coldwater disease and rainbow trout fry syndrome. In this study, we compared a wild‐type strain (CSF 259‐93) with a rifampicin‐resistant strain and virulence‐attenuated strain of F. psychrophilum (CSF 259‐93B.17). The attenuated strain harboured a mutation in the rpoB gene consistent with resistance to rifampicin. Two‐dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D‐PAGE) and mass spectrometry demonstrated an altered proteome with eight proteins characteristic for the parent strain and six that were unique to the attenuated strain. Immunoblotting with a diagnostic monoclonal antibody (FL‐43) identified a putative antigen (FP1493) that was subsequently cloned, expressed as a recombinant protein and confirmed as recognized by FL‐43. 2D‐PAGE, immunoblotting with rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), convalescent antisera and mass spectrometry of bacterial whole‐cell lysates revealed several uniquely expressed immunoreactive proteins including FP1493. An FP1493 recombinant subunit vaccine was tested, but did not provide protection against challenge with the CSF259‐93 strain. While the exact mechanism responsible for altered protein synthesis and attenuation of CSF 259‐93B.17 is still unknown, the differentially expressed immunoreactive proteins are a valuable resource to develop subunit vaccines and to identify proteins that are potentially involved in disease.