牙鲆弹状病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用

建立了牙鲆弹状病毒的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,首先根据牙鲆弹状病毒的糖蛋白的基因保守序列,利用Primer Explorer V3软件设计了6条引物,并对LAMP反应温度和反应时间等条件进行了优化。该方法的检测限为30fgRNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与鲤春血症病毒、传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、海洋双RNA病毒、病毒性出血败血症病毒以及病毒性神经坏死病毒等没有交叉反应。该方法检测时间短,在1h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明40尾石鲽鱼样品中有3尾感染HRV,与病毒分离结果一致,说明LAMP方法比较适合牙鲆弹状病毒的早期及现场诊断。     

对虾白斑综合症病毒变性高效液相色谱检测方法的建立与应用

据对虾白斑综合症病毒(WSSV)的基因保守序列,使用Primer Explorer V3软件设计了2条引物,利用PCR的扩增产物,结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,建立了一种对虾白斑综合症病毒的DHPLC快速检测方法。该检测方法特异性好,与传染性皮下和造血器官坏死病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒、对虾杆状病毒以及对虾基因组DNA无交叉反应;检测灵敏度较高,约为10-5ng/μL,高于常规PCR及荧光定量PCR的灵敏度。用建立的DHPLC方法对100尾对虾样品进行了临床检测,结果与荧光定量PCR检测结果一致。WSSV的DHPLC检测方法,特异性强、灵敏度高,是对WSSV进行有效检测的一种新方法。     

马媾疫锥虫SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种特异、快速的媾疫锥虫检测方法,本研究通过PCR方法从马媾疫锥虫动基体基因组中扩增得到395 bp的特异的保守序列,将其克隆到pMD-18T载体中构建重组质粒标准品,以10倍倍比稀释的质粒标准品为模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立马媾疫锥虫荧光定量PCR的检测方法。结果表明:该方法的检测灵敏度可达到1拷贝/μL,并且与马属动物其他传染病无交叉反应。其组间及组内变异系数分别小于3.183%和3.842%。该方法的建立为快速及特异性检测马媾疫锥虫提供了有效的方法。     

基于量子点标记技术的鸡新城疫病毒sFLISA检测技术研究

本研究建立了基于量子点的鸡新城疫病毒(NDV)sFLISA检测方法。该方法以抗NDV多克隆抗体为捕捉抗体、以生物素标记抗NDV单克隆抗体为检测抗体、以量子点标记的链霉亲和素为荧光探针。该方法与其它有关禽类病毒(产蛋下降综合征病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒)无交叉反应,比血凝试验灵敏,为临床早期快速检测NDV提供了行之有效的方法。     

真鲷虹彩病毒实时定量PCR检测方法的建立与应用

以真鲷虹彩病毒(Red-sea bream iridovirus,RSIV)主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)的基因保守片段为靶序列,利用Primer Express 3.0软件设计定量PCR引物,建立了RSIV的SYBR Green I实时定量PCR检测方法.将RSIV MCP基因连接pMD18-T载体,构建重组质粒,经过梯度稀释后作为标准品,根据标准品拷贝数(X)与Ct值的关系绘制了标准曲线,为Ct=-3.184 1gX+40.270,相关系数R2=0.996 9.熔解曲线分析表明,定量PCR产物的Tm值为82.5℃.该方法的检测限为2.20×102拷贝/反应,对流行性造血器官坏死病毒、淋巴囊肿病毒、蛙病毒3、甲鱼虹彩病毒都没有扩增反应,具有特异性.利用该方法对84批海水鱼类(石鲽、大菱鲆、鲈鱼)进行检测,其中5批鱼样品感染RSIV,并利用标准曲线对病毒含量进行了定量分析.     

解冻方式对南极磷虾加工品质的影响

为探究解冻工艺对南极磷虾加工品质的影响,对静水解冻、自然空气解冻和低温空气解冻3种方式的耗时进行了测量,并研究了南极磷虾经不同方式解冻后的感官特征,同时对非蛋白氮（non-protein nitrogen,NPN）、总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen,TVB-N）、硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances,TBARS）、脂肪酸组成等与品质相关的生化指标进行了测定。结果表明,采用静水解冻、自然空气解冻、低温空气解冻3种方式将中心温度为-18℃的南极磷虾冻块解冻完全的耗时分别为51、220和826 min;感官评分依次为静水解冻>自然空气解冻>低温空气解冻;3种解冻方式对应的NPN值有极显著差异（P<0.01）,依次为低温空气解冻>自然空气解冻>静水解冻;低温空气方式解冻的南极磷虾TVB-N值显著高于另2种方式（P<0.01）,而静水方式和自然空气方式之间TVB-N无显著差异（P>0.05）;3种解冻方式的TBARS值同样差异显著（P<0.01）,依次为静水解冻>自然空气解冻>低温空气解冻;南极磷虾脂肪酸组成中多不饱和脂肪酸比例较高,达到30%以上,低温空气解冻对多不饱和脂肪酸具有一定的保护作用。实际生产中,南极磷虾如用作一般食品加工适宜采用静水解冻的方式,而作为鱼粉加工适宜采用静水或自然空气解冻的方式,如提取虾油则适宜采用低温空气解冻的方式。研究结果为南极磷虾资源的高效利用提供参考。     

山东沿海部分地区真鲷虹彩病毒病初步调查与分析

2008年11月～2010年11月,采集山东海域大菱鲆、石鲽、鲈鱼各20批,按照世界动物卫生组织推荐的PCR检测方法对真鲷虹彩病毒病(Red Sea Bream Iridoviral Disease,RSIVD)进行初步调查.结果显示,共检出4例RSIVD感染样品.以真鲷虹彩病毒(Red Sea Bream Iridovirus,RSIV)和传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus,ISKNV)主要衣壳蛋白基因为基础,设计简并引物,PCR扩增本次检出阳性样品的RSIV/ISKNV MCP基因.将MCP基因PCR扩增产物测序,提交GenBank,并以MCP基因为基础,对被检出的阳性样品进行虹彩病毒属系统分类,绘制进化树.由进化树得出,4例阳性病毒株均属于虹彩病毒科细胞肿大病毒属.     

荷斯坦牛瓜氨酸血症焦磷酸测序检测方法的建立与应用

为建立一种快速高通量的荷斯坦牛瓜氨酸血症(Citrullinemia,CN)分子检测方法,依据CN是由于精氨酸琥珀酸(ASS)合成酶基因编码第86位精氨酸的密码子突变为终止密码子的遗传学基础,利用Assay Design SW软件设计了1对引物和1条测序引物对三种不同基因型的基因材料进行测序分析。用建立的方法对55份进境荷斯坦牛血样进行检测,发现有1例为隐性基因携带者,将PCR产物进行常规测序,结果与焦磷酸测序检测结果一致。研究表明该方法可用于荷斯坦牛瓜氨酸血症的检测,是一种有效的新方法。     

荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征焦磷酸测序检测方法建立与应用

为建立一种快速高通量的荷斯坦奶牛脊柱畸形综合征（complex vertebral malformation,CVM）的分子检测方法,根据CVM是由于SLC35A3基因第4外显子559位处发生G→T突变的遗传学基础,利用Assay Design SW软件设计了1对PCR引物和1条测序引物对三种不同基因型的基因材料进行测序分析,建立焦磷酸测序检测方法。对55份进境荷斯坦奶牛血样进行检测,发现有1例为隐性基因携带者,将PCR产物进行测序,其DNA序列与焦磷酸测序检测结果一致。研究表明该方法是一种有效的新方法,可用于荷斯坦奶牛脊椎畸形综合征的检测。     

2010年国际马病疫情动态

2010年在世界各国发生了数十起马病疫情,其规模不等、强度不一。如西尼罗热(马达加斯加、希腊、意大利、西班牙、保加利亚、葡萄牙、摩洛哥、伯利兹、罗马尼亚)、马鼻疽(巴林、巴西)、马接触传染性子宫炎(葡萄牙、美国、英国)、流行性出血热(法国瓜德罗普岛)、马病毒性动脉炎(乌拉圭、阿根廷、英国)、非洲马瘟(加纳)、马鼻肺炎(阿联酋)、马传染性贫血(比利时、法国、德国、英国、希腊)、水泡性口炎(美国)、马梨形虫病(美国)、委内瑞拉马脑脊髓炎(巴拿马、伯利兹)、东部马脑脊髓炎(巴拿马)、炭疽(哈萨克、乌干达)。西尼罗病毒病多次在欧洲国家出现,马脑脊髓炎多次出现在拉丁美洲国家,马接触传染性子宫炎在赛马业高度发达的美国、英国似乎变成了地方性流行病,这些动物疫病在流行病学上出现了新变化,应引起我国兽医部门和出入境检验检疫部门的高度重视,严防疫情疫病传入传出,特别是防止新发疫病(马脑病、西尼罗病毒病)传入国境,保障我国畜牧业的健康发展。