粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03侵染楚雄腮扁叶蜂幼虫的扫描电镜及透射电镜观察

目的了解粉红粘帚霉对楚雄腮扁叶蜂幼虫的侵染过程,为粉红粘帚霉对楚雄腮扁叶蜂的致病机理研究提供参考。方法利用扫描电镜和透射电镜技术对粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03孢子侵染楚雄腮扁叶蜂幼虫体表过程及其超微结构的变化进行观察研究。结果扫描电镜结果显示,接种6 h后,粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03分生孢子成功附着于幼虫体壁的气门、节间膜等部位;接种14 h后,粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03孢子萌发出芽管,并侵入体壁;接种26 h后,孢子和菌丝穿透楚雄腮扁叶蜂幼虫体壁,且菌丝迅速生长;接种72 h后,菌丝穿出虫体表面,并长出产孢结构。透射电镜观察发现粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03菌丝在穿透幼虫体壁过程中,会伴随酶的参与和组织溶解现象;接种6 h后,粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03分生孢子附着于幼虫体壁的两个节间褶间的部位;接种14 h后,分生孢子萌发并进入表皮细胞层分泌物中;接种26 h后,菌丝侵入表皮并扩展蔓延,且在菌丝周围出现电子密度很低的光晕;接种38 h后,皮细胞层细胞排列松弛变成空泡;接种48 h后,菌丝充满虫体,表皮层出现大量菌丝。结论粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03孢子及菌丝能寄生楚雄腮扁叶蜂幼虫,并可致其死亡。观察结果准确反映了粉红粘帚霉SWFUYHL 02-03对楚雄腮扁叶蜂幼虫的侵染过程,并证实了侵染过程中酶与代谢产物的存在。      

2株楚雄腮扁叶蜂虫生真菌培养条件及产孢特性研究

对2株楚雄腮扁叶蜂虫生真菌(NH512、Y512)菌株培养条件及产孢特性进行研究,分析温度、光照及紫外线诱导对菌株生长和产孢的影响。结果表明:NH512菌株菌丝的生长最适温度为25℃,在此温度下培养15 d时的平均菌落直径为48.15 mm;Y512菌株菌丝的生长最适温度为20℃,在此温度下培养15 d时的平均菌落直径为64.20 mm;25℃条件下培养15 d,NH512菌株和Y512菌株累计产孢量均最大,分别为9.184×107个/cm~2和3.091×107个/cm~2。黑暗-光照12 h交替条件可以促进NH512菌株和Y512菌株菌丝生长,培养15 d时平均菌落直径均最大,分别为40.10、44.40 mm;无光照条件有利于NH512菌株产孢,而黑暗-光照12 h交替条件能促进Y512菌株产孢,培养15 d时NH512菌株、Y512菌株平均产孢量分别为9.184×107、9.038×107个/cm~2。紫外线诱导能促进NH512菌株的菌丝生长,抑制Y512菌株的菌丝生长;紫外线诱导能抑制NH512菌株产孢,而紫外线诱导能大大促进Y512菌株产孢,平均累计产孢量增加到15.69×107个/cm~2。     

楚雄腮扁叶蜂虫生真菌粉红粘帚霉的鉴定及其生物学特性

为明确楚雄腮扁叶蜂Cephalcia chuxiongica病原真菌的种类,以组织分离法对自然罹病死亡的楚雄腮扁叶蜂进行虫生真菌的分离培养,根据形态学特征和rDNA ITS序列分析对所得虫生真菌进行鉴定,并对其中的高毒力菌株进行生物学特性测定。结果表明:共分离得到4属25株菌株,其中以粉红粘帚霉Clonostachys rosea出现频率最高,共分离到15株,均与GenBank中粉红粘帚霉相关菌株亲缘关系最近,ITS序列同源性达100%,属优势种。按照柯赫法则证实4个属的虫生真菌对楚雄腮扁叶蜂均有致病力,其中粉红粘帚霉致病力最强,其高毒力菌株SWFUYHL 02-01对楚雄腮扁叶蜂幼虫致死中时为10 h;蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂培养基最适宜该菌株生长和产孢,其次是马铃薯葡萄糖琼脂培养基;该菌的最适生长温度为25℃,光照对其菌丝生长无显著影响;在以不同种类糖为碳源的培养基上该菌株均能生长,以蔗糖为碳源的培养基上产孢量最高,显著高于以其它糖为碳源时;适宜其生长的氮源是酵母浸出粉,适宜产孢的氮源是硝酸铵和尿素,以硫酸铵和酵母浸出粉为氮源时不产孢;适宜菌丝生长和产孢的无机盐分别是MnSO_4和MgSO_4,添加CaCl_2的培养基上未见产孢;光照对粉红粘帚霉孢子萌发无显著影响。粉红粘帚霉菌株在采样点的出现频率与其生物学特性完全吻合。