农杆菌介导洋桔梗遗传转化影响因素的研究

以洋桔梗品种Double Mariachi Pink叶片为外植体,研究了影响农杆菌介导遗传转化效率的几个重要因素。结果表明,叶片外植体与农杆菌合适的共培养时间为5 d;以新的切割方法——刺孔法切割叶片,每个叶块外植体再生不定芽平均15.22个,明显多于三刀切的11个;刺孔法的叶块转化率达到77.7%,每个叶块再生卡那霉素抗性苗平均0.64株,明显高于三刀切的57.7%和0.38株;在刺孔法处理中,与孔外边缘切口相比,分布均匀的孔内切口利于更多不定芽的再生和卡那霉素抗性苗的形成。     

烟草品种Xanthi NN碱性β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆与生物信息学分析

烟草碱性β－1,3－葡聚糖酶具有较强的抗真菌病害等作用。本研究根据烟草Samsun与抗真菌作用有关的碱性8—1,3－葡聚糖酶基因序列设计引物,以烟草（Nicotiana tabacum）品种Xanthi NN基因组DNA为模板,进行PCR扩增,后将扩增产物与pUC57－T载体重组,再以该重组体转化大肠杆菌DHSα,在对阳性克隆进行鉴定后测序,并对其编码酶蛋白进行了一级、二级、三级结构及蛋白质同源性比较等生物信息学分析。研究结果表明,该基因全长1868bp,包含2个外显子和1个内含子;除终止密码子外,共编码359个氨基酸（GenBank登录号：EU867448）。该酶分子量为28．4kDa,pI为9．72,是一个碱性蛋白;具有多个螺旋、转角、延伸链和无规卷曲等二级结构,其中α－螺旋占35．65％,β－转角占5．57％,延伸链占19．22％,无规卷曲占39．55％;三级结构同源建模预测显示,它与香蕉（Musa supientum）β－1,3－葡聚糖酶（PDB number 2cygA）具有60％的一致性;推测该酶蛋白与颠茄（Atropa belladonna）、马铃薯（Solanum tuberosum）等茄科植物的β－1,3－葡聚糖酶编码序列同源性分别达到89％和81％。本研究结果为进一步开展烟草抗真菌的β—1,3－葡聚糖酶的基因工程研究奠定了重要基础。     

利用正交设计建立洋桔梗RAPD最佳反应体系

利用正交设计法对影响洋桔梗RAPD反应的Mg2 、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、引物和模板等主要因素的作用进行了比较分析,建立了洋桔梗RAPD的最佳反应体系:即在25 μL反应体积中,10×PCR buffer为2.5 μL ,Mg2 浓度为2.0 mmol/L,dNTPs浓度为0.4 mmol/L,引物浓度为0.2 μmol/L,模板浓度为50 ng/μL,Taq DNA聚合酶用量为1.0 U;在此基础上,比较了不同退火温度对RAPD扩增产物的影响,退火温度经筛选选定为41℃;最后再将该反应体系应用于不同引物,结果表明该优化结果具有较好的稳定性和通用性.     

洋桔梗ISSR最佳反应体系的建立与品种遗传多样性检测

利用正交设计,对影响洋桔梗ISSR反应的主要因素进行了优化,建立了洋桔梗ISSR的最佳反应体系。在25μL的PCR反应体系中,含2.5μL 10×PCR buffer、1.5 mmol/L Mg2+、0.3 mmol/L dNTPs、0.2μmol/L引物、30 ng/μL洋桔梗基因组DNA模板及2.0 U的TaqDNA聚合酶。试验结果表明,该反应体系具有良好的稳定性和通用性。8个不同基因型洋桔梗材料遗传多样性检测结果表明,该ISSR分子标记可有效地检测出其中4个不同品种之间、同一品种F1代及F2代之间的遗传多样性,但未能检测出同1个品种F1代2个株系之间或2个转基因株系之间的遗传多样性。     

月季离体培养植株高效再生体系的建立

以月季品种红双喜为试材,以MS为基本培养基,研究不同6-BA与NAA浓度配比、不同芽龄对丛生芽增殖的影响,不同NAA浓度与培养基大量元素强度组合对芽苗再生根诱导的影响等。结果表明:月季品种红双喜丛生芽增殖的最佳培养基为MS 6-BA 2.0 mg/L NAA 0.05 mg/L,增殖倍数可达5.0;芽龄在5周以上的腋芽丛生芽增殖倍数可达5.0以上;芽苗再生根诱导的最佳培养基为1/2MS NAA 0.05 mg/L,再生根诱导率可达90%,平均再生根数为8.1条,瓶苗的移栽成活率高达100%。本研究成功建立了月季品种红双喜离体培养植株高效再生体系,为进一步开展月季基因工程研究奠定了基础。