青枯雷尔氏菌Ⅲ型分泌系统hrcN基因的功能分析

hrcN是植物病原菌Ⅲ型分泌系统基因（T3SS）的结构基因之一,对病原菌的致病力有重要影响。本研究克隆青枯雷尔氏菌CBM613的hrcN基因并作生物信息学分析,结果显示该基因长度为1320 bp,共编码439个氨基酸,预测HrcN蛋白无信号肽,无跨膜区域,整体呈弱亲水性,该蛋白为ATP酶,定位于细胞内膜和细胞质。基因敲除结果显示,菌株CBM613的hrcN突变体与野生型菌株在富营养培养基上的生长速率差异不明显,而在贫营养培养基上前者的生长速率显著快于后者。敲除hrcN基因后,青枯雷尔氏菌的运动能力无明显变化,生物被膜形成能力显著降低。以敲除突变型和野生型青枯雷尔氏菌株接种番茄,与后者相比,前者的致病力下降,病情指数降低,病程延长,但并未完全丧失致病力,表明hrcN基因是青枯雷尔氏菌致病性相关的重要基因。本研究为进一步探索青枯雷尔氏菌致病机制及防治具有重要意义。     

柑橘溃疡病菌EMA-PCR快速活体检测技术的建立

传统PCR方法不能诊断柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri Gabriel)的死活状态,往往导致假阳性检测结果.本研究将特异性核酸染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)与PCR技术结合,旨在建立柑橘溃疡病活菌的快速检测技术.根据柑橘溃疡病菌独有的保守蛋白基因设计特异性引物扩增出278 bp的靶带,PCR反应的检测下限为25个细胞/25 μL或2.75 pg/25 μL.EMA-PCR结果表明:当卤钨灯曝光时间1 min,EMA终浓度为1.0 mg/L时,能有效抑制1.0×108 cfu/mL死菌的扩增;当EMA的浓度小于30 mg/L时,EMA对上述相同浓度活菌靶基因的扩增没有明显的抑制.EMA-PCR对死活混合菌的扩增表明,活菌数在6.875×101～6.875×105 cfu/PCR范围时,荧光强度与混合体系中活菌的对数值有线性关系.基于以上建立的EMA-PCR活体检测技术,对疑似带病柑橘材料进行检测,结果发现能降低柑橘溃疡病菌检测过程中的假阳性,有望为柑橘溃疡病的检疫检验提供更科学的技术手段.     

利用EMAqPCR建立快速检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法

利用叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合(EMA-qPCR),建立了一种有效快速检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法。以猕猴桃溃疡病菌ITS序列为检测靶标,菌体经EMA渗透处理,再进行qPCR特异性扩增。结果显示,qPCR检测灵敏度为2cfu;当EMA的浓度为2.0μg/mL时,能有效抑制1.0×10~7 cfu/mL经高温灭活的死菌的扩增,对活菌的扩增没有影响。当活菌数在1.0×10~1~1.0×10~5 cfu范围内,每个qPCR反应体系中活菌数与Ct值呈线性相关(R~2=0.988)。不同温度处理活菌菌悬液后用EMA-qPCR检测猕猴桃溃疡病菌的存活情况并与平板计数法进行比较,结果表明待检样品可在4℃和20℃短期保存。对疑似带病猕猴桃材料进行EMA-qPCR检测,结果表明能减少猕猴桃溃疡病菌PCR的假阳性结果。本研究建立的EMAqPCR方法是一种有效检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法,能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果。     

青枯菌Ⅲ型分泌系统HrcN原核表达与亚细胞定位

为探究青枯菌Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secretion system，T3SS）HrcN在致病过程中的功能，分别克隆青枯菌CBM613菌株的hrcN基因并连接至pET30a和pRI-eGFP载体，转化寄主细胞，开展原核表达及亚细胞定位研究。结果显示，HrcN蛋白是T3SS的结构组分之一，具有ATP酶活性，可在胞内水解ATP酶为效应蛋白的分泌过程提供能量。蛋白亚细胞定位预测表明，青枯菌HrcN蛋白定位于细胞内膜和细胞质，激光共聚焦定位结果显示，HrcN蛋白部分在叶绿体表达，部分在细胞内膜和细胞质表达，与蛋白亚细胞定位预测结果基本一致。据此推测HrcN是一种定位于细胞内膜上的外周蛋白，该结论为后续研究青枯菌T3SS的功能及其致病机制奠定基础。     

青枯雷尔氏菌温度相关致病基因yqhE功能研究

不同温度下青枯雷尔氏菌表达谱PPI网络分析发现，yqhE可能是青枯雷尔氏菌新的温度相关致病基因。克隆青枯雷尔氏菌CBM613的yqhE基因，结果发现该基因长度为831 bp，共编码276个氨基酸。基因敲除结果显示，28℃培养的yqhE突变株较野生型菌株致病力降低，病程延长，但并未彻底丧失致病力。20℃和28℃培养的yqhE突变株维生素C的生物合成皆被抑制；与28℃相比，20℃培养下野生型菌株维生素C的合成能力降低。突变株在20℃和28℃培养下甲基乙二醛（MG）和丙二醛（MDA）明显积累，其中20℃积累更多；20℃培养的野生型菌株MG和MDA比28℃积累更多。维生素C的生物合成被抑制导致青枯雷尔氏菌自由基清除能力减弱与氧化应激反应增强，MG和MDA积累产生细胞毒性，上述结果可能与28℃培养的突变株致病力减弱，20℃培养的野生型菌株致病力丧失有关。综上结果表明yqhE是青枯雷尔氏菌温度相关致病基因。     

H_2S可能作为H_2O_2的上游信号介导茉莉酸甲酯诱导竹根姜对青枯菌的抗性

为探讨H_2S和H_2O_2在茉莉酸甲酯(MeJA)诱导竹根姜抗姜瘟病过程中的上下游关系,以竹根姜幼苗为研究对象,采用MeJA、NH_2OH+MeJA、AsA+MeJA、无菌水等进行喷雾,观察竹根姜发病情况,并对H_2S、H_2O_2、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和木质素等指标进行检测。结果显示,MeJA处理可以显著降低竹根姜的病情指数,提高抗病性,而H_2S合成抑制剂NH_2OH和H_2O_2清除剂AsA均抑制MeJA诱导的抗病效果。进一步研究发现,MeJA能够明显促进H_2S(主要由半胱氨酸脱巯基酶合成)和H_2O_2的合成以及半胱氨酸脱巯基酶的活性,提高木质素合成相关酶(PAL和POD)活性,促进木质素合成。H_2S合成抑制剂NH2OH可降低半胱氨酸脱巯基酶的活性并抑制H_2S和H_2O_2的产生,而H_2O_2清除剂AsA可抑制H_2O_2的产生,但对H_2S的合成和半胱氨酸脱巯基酶的活性没有影响。由此证明,H_2S可能作为H_2O_2的上游信号参与竹根姜对MeJA的响应。MeJA在竹根姜细胞内进行有效的信号传导,通过调控细胞内下游信号分子H_2S和H_2O_2的产生,激活木质素合成相关酶的活性,促进木质素的合成,提高竹根姜对青枯菌的抗性。