fl(2)d单等位基因的敲除显著降低小菜蛾的生殖力和育性

【目的】RNA甲基化是基因转录后水平表观修饰的主要形式,参与了众多重要的细胞学过程。小菜蛾（Plutella xylostella）是危害十字花科蔬菜的重要寡食性害虫,与RNA甲基化相关基因的功能尚未见报道。本研究通过克隆小菜蛾的RNA甲基化蛋白同源基因fl(2)d,鉴定其表达模式,并敲除该基因以探究其生物学功能。【方法】通过小菜蛾基因组网站查找fl(2)d基因序列,PCR扩增其蛋白质编码序列（CDS）;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术,检测小菜蛾不同发育阶段个体以及成虫生殖腺中fl(2)d的相对表达量;运用CRISPR/Cas9结合卵的显微注射技术,对小菜蛾fl(2)d进行编辑;将fl(2)d被编辑过的成虫与野生型成虫杂交,并对其产生的后代进行近交,筛选fl(2)d突变品系;观测并比较突变体与野生型个体遗传特性、生物学参数和表型的差异,明确fl(2)d的功能。【结果】克隆得到长度为912 bp的fl(2)d CDS,fl(2)d在雌蛹、雌成虫和卵中的表达量较高,雄成虫和雄蛹的表达量较低,幼虫期的表达量最低,成虫卵巢中表达量显著高于精巢。通过向小菜蛾的卵注射靶向fl(2)d的向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白的混合物,对所产生的阳性后代进行10代的单对近交筛选,获得3种杂合的移码突变品系,分别缺失了4个（Δfl(2)d213-4）、5个（Δfl(2)d213-5）和7个（Δfl(2)d214-7）碱基。在上述品系的筛选过程中,发现了6只缺失4个碱基的纯合突变个体,2只缺失5个碱基的纯合突变个体;缺失4个碱基的纯合个体成功配成了两对,近交未产卵;剩余的2只缺失4个碱基的雄性纯合个体和2只缺失5个碱基的雄性纯合个体分别与同世代的雌性杂合突变个体近交后仍未产卵。说明fl(2)d纯合突变的个体存活率极低,且可能无法产生后代。通过分析后代基因型的分离比,发现杂合突变个体近交以及杂合突变个体与野生型个体杂交产生的后代中,杂合突变个体与野生型个体的比例分别略小于2和1,说明fl(2)d杂合突变会影响小菜蛾正常的生长发育,并导致部分个体死亡。杂合突变体后代中含有突变的雌雄个体比例接近1﹕1（P<0.05）,推测小菜蛾fl(2)d可能与性别决定无关。只要是有突变品系小菜蛾所参与的交配,雌成虫产卵量和卵的孵化率均显著低于野生型（P<0.01）,所产的卵多数发育异常,表现为失水皱缩、不能正常孵化。通过对成虫的生殖腺进行解剖,发现在野生型雌成虫与突变体雄成虫交配后,卵巢内卵的附着量较未交配的个体明显减少;未交配的突变体雌成虫卵巢内卵的附着量亦少于野生型,而突变体雄成虫的精巢未见明显异常。部分能够孵化的杂合突变个体在整个发育过程会发生不同程度的畸变,导致不能正常完成整个世代;另外一些杂合突变个体未见异常,可以将突变类型遗传给后代。根据上述发现,提出了基于fl(2)d的小菜蛾遗传防控模型。【结论】fl(2)d参与小菜蛾的生殖过程和胚胎发育,突变后显著影响后代种群数量,是开展小菜蛾遗传控制的理想靶标。     

番木瓜酪氨酸氨基转移酶基因CpTAT的分离与分析

番木瓜酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase,TAT)是维生素E合成途径中的一个关键酶。在已有番木瓜果实成熟差异基因片段序列的基础上,采用RACE技术克隆了TAT基因的全长c DNA序列,命名为Cp TAT。该基因全长包含5′非编码区98 bp,3′非编码区232 bp,开放性阅读框1 266 bp,编码421个氨基酸。序列分析表明,该基因为谷草转氨酶超家族成员,催化活性位点为第253位的赖氨酸,编码蛋白与毛果杨、野草莓、桃、拟南芥和水稻的TAT蛋白同源性分别为83.69%、81.09%、80.76%、78.87%、54.67%。荧光定量分析表明,Cp TAT基因在根中的表达量最高,在茎和果实中的表达较低,在叶中的表达量最低。与对照相比,外源乙烯处理能诱导番木瓜果实中Cp TAT基因表达量升高,而1-MCP处理则抑制了该基因表达,在果实衰老期表达量升高,该基因可能在番木瓜果实成熟衰老中起作用。     

仙人球种子萌发特性初探

为了解仙人球种子的特性,探讨光照、GA3和6-BA对仙人球种子萌发的影响,观察了仙人球种子的吸水率,测定了不同浓度的GA3和6-BA(0、10、30、50、100mg·L-1)浸种以及黑暗和光照条件下的发芽率和发芽势。结果表明:室温下仙人球种子吸水率在24h达到饱和为30%;最有利于仙人球种子萌发的GA3浓度为100mg·L-1,而6-BA对仙人球种子萌发作用不大;光照条件下的仙人球种子发芽率和发芽势明显高于黑暗条件下,推断仙人球种子属于喜光种子。     

‘云香’水仙ACC氧化酶基因克隆及遗传转化

以‘云香’水仙花瓣为试验材料,采用RT-PCR技术克隆出乙烯生物合成途径中的关键酶ACC氧化酶(ACO)基因的全长序列1 162 bp,命名为NtACO1(GenBank登录号为KX082935)。其开放阅读框(ORF)长度为939 bp,编码312个氨基酸。NtACO1蛋白包括ACO家族保守的DIOX_N和20G-FeⅡ_Oxy结构域。分子进化树分析表明,NtACO1蛋白与‘金盏银台’水仙亲缘关系最近。通过qRT-PCR检测NtACO1在‘云香’水仙花朵开放过程中的表达模式,结果表明,NtACO1在花瓣和副冠中的表达量随着花朵发育衰老而逐渐上升,并且各个时期花瓣中的表达量都高于副冠,推测NtACO1可能参与了‘云香’花的发育和衰老。构建了NtACO1的正、反义植物表达载体,并以烟草叶片为外植体,通过根癌农杆菌介导的遗传转化体系,获得NtACO1过表达转基因植株。转基因烟草与野生型相比缩短了营养生长期,开花较早,叶片较少。该研究为进一步探究水仙花ACO基因功能,以及延长水仙花花期的分子育种奠定了试验基础。     

番木瓜半胱氨酸蛋白酶基因CpCP的分离及表达分析

采用cDNA-AFLP技术分离了一个与番木瓜果实成熟衰老相关的差异片段,经生物信息学分析证实该片段属于半胱氨酸蛋白酶（Cysteine Protease,CP）基因。将差异片段序列在NCBI中的番木瓜基因组序列中搜索,获得了半胱氨酸蛋白酶基因DNA序列。设计开放型阅读框上、下游引物,以木瓜果肉RNA逆转录的cDNA为模板扩增该基因全长cDNA序列,命名为CpCP（登录号：JN689334）。该基因属于C1肽酶家族中的C1A亚家族,编码471个氨基酸,含有家族特有的催化三联体：Cys166-His302-Asn322。Real-time PCR结果显示CpCP在果实中大量表达,是根、茎、叶、花中表达量的几十倍;CpCP受乙烯处理诱导,受1-MCP处理抑制,表达模式与番木瓜果实成熟衰老进程一致,说明CpCP参与了番木瓜果实成熟衰老进程。     

番木瓜NAC转录因子的克隆与表达分析

为探究番木瓜NAC转录因子的序列特征及功能,以‘大庆7号’番木瓜果肉为试验材料,采用RTPCR克隆出2个不同的NAC类基因,命名为CpNAC1(Gene Bank KT364871)和CpNAC2(Gene Bank KT372241),其开放阅读框(ORF)长度分别为609 bp和805 bp,分别编码202个和268个氨基酸,其N端含有NAM保守结构域。采用实时荧光定量PCR研究其在乙烯利及清水对照处理后果实不同成熟时期中的表达情况,结果发现,CpNAC1和CpNAC2基因随着处理后时间的增加,表达量呈先下降后缓慢上升的趋势,且均与果实成熟呈负相关。但CpNAC1表达趋势与果实成熟过程中乙烯的表达量相反,受乙烯抑制降低表达量,从而参与了番木瓜果实的成熟衰老进程,而CpNAC2基因在乙烯处理后番木瓜果实中表达量与对照处理相比没有显著变化,说明CpNAC2基因不是通过乙烯信号传导途径来调控果实成熟。