烟叶中纤维素高效降解菌的筛选与作用效果研究

为有效降解烟叶中的纤维素,改善烟叶的整体品质,从不同产地原烟表面初步分离出具有降解纤维素能力的菌株;通过测定菌株所产纤维素酶活性,筛选高产纤维素酶菌株并进行16 S rDNA测序,结合生理生化试验对其进行鉴定;进一步采用正交试验优化菌株在烟叶中的发酵条件,考察烟叶中纤维素降解效果。结果表明:1)在分离得到的18株菌株中,XC-19-1产纤维素酶活性最高(6.6 U·mL~(-1));2)16 S rDNA测序以及生理生化试验推断,XC-19-1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);3)根据正交试验的结果,将培养后的XC-19-1菌液按照3%的烟叶质量比例施加于抽梗后的烟叶表面,在温度为37℃、相对湿度为75%的条件下作用60 h后,烟叶中的纤维素降解率可达30.6%,总糖以及还原糖含量均有明显提高,有效提升烟叶整体质量。     

原烟发酵过程化学成分的变化规律

为阐明打叶复烤工艺对烟叶自然发酵的影响,考察室温条件下原烟与片烟发酵过程中的化学成分变化规律差异。收集6个不同地区的初烤后原烟,同时对这6种烟叶进行模拟打叶复烤制成片烟,将原烟及片烟同时放置在室温下自然发酵60 d,定期取样并检测常规化学成分(水溶性总糖、还原糖、淀粉、烟碱及总氮)含量。结果表明:随着发酵进行,原烟中淀粉、水溶性总糖含量均有所减少,还原糖含量稍有增加,总氮含量呈下降趋势;而片烟中淀粉、总糖及还原糖含量变化均不明显,但总氮含量略有下降;统计分析显示,原烟和片烟在发酵60 d后上述4种化学成分的变化量均存在差异性(0.01P0.05)。发酵过程中,2种烟叶的烟碱均有不同程度的降低,但变化差异较小。在60 d的自然发酵过程中,前45 d原烟化学成分含量变化较为剧烈,后15 d各化学成分含量渐趋于稳定。研究结果证实自然发酵过程中,原烟的内在化学成分含量变化较为剧烈,而片烟则无明显变化,因此复烤工艺是影响烟叶自然发酵的一个关键因素。     

果胶酶降解混合浆果胶的条件优化及热裂解分析

为研究黑曲霉产果胶酶生物降解在再造烟叶所含果胶的含量,改善烟草薄片的品质,以河南中烟再造烟叶工艺生产线上的高浓混合浆为原料,采用单因素及正交试验法对果胶酶降解果胶工艺条件进行优化。结果表明,果胶降解最佳反应条件为酶活力为10 000 U/m L、料液比1∶1(g∶m L)、反应温度50℃、处理时间3.0 h,果胶降解率达到最大,为29.26%±1.06%。高浓混合浆经酶解后经在线裂解气相色谱/质谱法(PY/GC-MS)分析发现,裂解产物成分的组成、含量均发生了明显的变化。酶处理前后醛酮类和杂环类化合物的相对含量分别增加2.03和1.96个百分点,酸类、酯类、萜烯类、苯环及酚类、醇类化合物的含量分别降低了0.50、1.17、0.80、1.32、0.04个百分点。对比裂解前后的产物的种类、数量与相对含量发现,利用黑曲霉产果胶酶降解高浓混合浆中的果胶,作用明显。感官评价表明,酶解后的样品添加于卷烟中,使得卷烟香气更加柔和,刺激性减轻,透发性好,但香气量略有不足。     

叶绿素降解工程菌株的构建

为特异、高效地降解烟叶中的叶绿素,从模式植物拟南芥中克隆获得了叶绿素酶基因At CLH1片段,大小为975 bp。通过构建表达载体p ET28a-At CLH1,并转化大肠杆菌BL21,获得了重组工程菌株。该菌株在30℃下,经0.5 mmol/L IPTG诱导培养22 h,可较好地表达重组蛋白At CLH1,蛋白质电泳图谱显示其大小约为35 ku。该菌株的叶绿素酶活力可达24.9 U/m L,能够明显降解烟叶提取物中的叶绿素,在提升低次烟叶品质方面具有很好的应用前景。     

原烟复烤前后细菌种群变化研究

为明确原烟复烤前后表面细菌种群变化情况及其对烟叶发酵的影响,考察了3种不同烟叶(自然状态下的原烟、施加微生物的原烟、复烤后片烟)经发酵后微生物及化学成分的变化情况。不同烟叶发酵1个月后,利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法研究表面细菌的变化情况,并采用连续流动分析法检测化学成分的变化规律。结果表明:与原烟相比,复烤后烟叶表面的细菌发生明显变化,其中降解蛋白质菌(Bacillus cereus)、降解淀粉菌(Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis)、产香菌(Erwinia、Pantoeadispersa)等细菌的数量均明显低于复烤前的原烟。发酵后,原烟表面富集上述几类细菌,而复烤后烟叶表面细菌则未得到明显富集,部分细菌已检测不到。烟叶发酵1个月后,淀粉、蛋白质、氮含量均降低,还原糖含量显著增加,且原烟的化学成分变化幅度显著高于复烤后烟叶。表明复烤工艺可造成烟叶表面细菌种类和数量减少,由此影响烟叶发酵过程。     

陈化烟叶中1株果胶酶高产菌的分离、筛选与鉴定

烤烟中的高果胶含量严重影响烟草吸食品质和陈化速度。为降低烟草中的果胶含量,提高烟草及烟草制品的品质及安全性,从不同年份和不同产地的18份复烤烟草中共分离筛选出有降解果胶能力的细菌38株和真菌9株。其中,XC-8、XC-30、SMXP-57、SMXP-58、SMXP-62共5株细菌具有较高的降解果胶的能力,在发酵时间24 h、发酵温度30℃、接种量10%条件下果胶酶活性分别为176、179、143、192、121 U/mL。其中,菌株SMXP-58酶活性最高(192 U/mL),通过16S r DNA序列分析并结合形态、理化特性分析,确定SMXP-58菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。将SMXP-58菌株制成的菌剂(9.6×107个/mL)喷施于100 g烟叶表面,发酵3 d的烟叶评吸总分提高了1.02,进一步优化发酵条件,在发酵时间60 h、菌液量1 mL、水量20 mL的条件下,烟叶中果胶含量最低(7.45%)。     

烟叶中1株可高效降解淀粉的菌株筛选与作用效果研究

为有效降低烟叶中的淀粉含量、提高烟叶品质,从不同产地原烟表面初步分离具有降解淀粉能力的菌株,通过测定菌株的淀粉酶活性筛选高效产淀粉酶菌株,并对筛选菌株基因组DNA进行16S rDNA测序,同时结合生理生化试验对其进行鉴定。结果表明:在分离得到的22株菌株中,XC-3菌株产淀粉酶活性最高(116 U/mL);根据其16S rDNA测序结果以及生理生化试验结果推断,XC-3为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。进一步采用正交试验优化XC-3菌株在烟叶中的发酵条件,并考察其对烟叶中淀粉的降解效果。结果显示,将培养后的XC-3菌液(OD600=2.0)按照3%的烟叶质量比例接种于抽梗后的烟叶表面,在37℃条件下发酵48 h后,烟叶中的淀粉降解率可达29.84%,烟叶的总糖、还原糖含量上升,有效提升了烟叶的整体质量。     

河南浓香型烤烟叶面不同分切区位非挥发性有机酸含量和感官质量的变化

摘要： 为进一步探索烟叶分切加工的化学物质基础,以河南浓香型初烤烟叶为材料,从叶尖到叶基分切成10段（HN-1~HN-10）,利用单因素方差分析、相关回归分析研究了叶片不同分切区位非挥发性有机酸含量的变化,并基于非挥发性有机酸含量对不同区位进行聚类分析和感官评价。结果表明：①不同分切区位非挥发性有机酸总量平均为124.22 mg/g,变幅为41.70~193.40 mg/g,各组分平均含量表现为苹果酸（89.38 mg/g）＞草酸（18.07 mg/g）＞柠檬酸（13.48 mg/g）＞丙二酸（3.13 mg/g）＞丁二酸（0.17 mg/g）;②草酸和丙二酸在不同区位间的差异达到极显著水平;③丙二酸、柠檬酸含量与分切区位（HN-1→HN-10）呈极显著负相关关系,草酸与分切区位呈极显著正相关关系,从叶尖到叶基,草酸含量呈逐渐增加的抛物线型变化,丙二酸和柠檬酸含量均呈逐渐降低的线性变化;④可将不同区位聚为两段,第一段（HN-1~HN-7）非挥发性有机酸含量为124.68 mg/g,第二段（HN-8~HN-10）含量为123.15 mg/g;⑤两段式分切烟叶样品的感官评吸结果为第一段（43.19分）＞整片（42.08分）＞第二段（41.04分）,且第一段的得分显著高于整片和第二段,说明切除叶基3/10的烟叶有望作为高端原料的替代。