禾谷镰孢复合种毒素化学型及遗传多样性分析

【目的】明确不同省（自治区）引起玉米穗腐病的禾谷镰孢复合种（Fusarium graminearum species complex,FGSC）的毒素化学型和它们之间的遗传差异以及亲缘关系。【方法】选用根据基因Tri13和Tri3序列设计的特异性引物分析来自11个省（自治区）的92株禾谷镰孢复合种菌株的毒素化学型;从100条哥伦比亚大学（UBC）开发的通用引物中筛选出13 条扩增条带丰富、重复性好、信号强、背景清晰的引物,利用筛选出的引物对供试菌株进行ISSR-PCR扩增,使用Popgen32软件计算多态性位点百分率、Shannon’s多样性指数、群体间的遗传距离和遗传相似性;依据Nei’s 遗传距离,利用NTsys2.10e软件进行UPGMA聚类分析,并构建供试菌株的聚类图。【结果】供试的92株禾谷镰孢复合种菌株的产毒素化学型有4种：DON、15-ADON、DON+15-ADON和NIV+15-ADON。其中产生DON和15-ADON的菌株分别为1株和20株;同时产生15-ADON和NIV的有1株;同时产生15-ADON和DON的有55株。筛选出的13条引物对所有供试菌株进行PCR扩增,共获得102条带,其中多态性条带101条,多态性比率为99.02%,平均每条引物产生条带为7.85条。在群体平均水平上,基因多样性指数（H）为0.3129,Shannon’s的信息指数（I）为0.4774,表明禾谷镰孢复合种存在较高的遗传多样性水平;不同地理种群间,各群体的遗传多样性水平具有一定差异,河北、山西、黑龙江和吉林种群遗传多样性最高,安徽和河南种群最低。地理种群间的基因分化系数（Gst）为0.2722,说明不同地理种群间存在一定的遗传变异,但大部分遗传变异（72.78%）发生在种群内。遗传分化系数估算的基因流值Nm=1.3372（＞1）,表明不同地理种群间存在一定的基因流动;遗传关系结果表明河北、山西、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古和甘肃菌株群体间亲缘关系较近,山东、江苏、河南和安徽菌株间亲缘关系较近,安徽和内蒙古菌株间的亲缘关系最远。聚类分析显示所有菌株相似系数为0.43-0.95。在相似系数为0.43时,所有菌株分成2大类群,Group 1包括4株北方春播区菌株（吉林、山西和河北张家口）,不产生NIV和DON;Group 2由余下的88株菌株构成,产生的毒素类型主要为DON和15-ADON,其来源于北方春播区（山西、黑龙江、吉林、辽宁、甘肃和河北张家口、唐山）和黄淮海夏播区（河北石家庄、河南、山东、江苏和安徽）,在相似系数为0.664时,各类群分成不同的亚群,亚群的结果与菌株来源有一定的相关性。聚类分析结果和毒素化学型分析显示,同一地理种群的菌株多数聚在一起,个别菌株分散到不同的分支上。【结论】北方春播区和黄淮海夏播区的禾谷镰孢复合种主要的毒素化学型为DON和15-ADON。引起玉米穗腐病的禾谷镰孢复合种菌株群体内存在丰富的遗传变异,不同地理种群间存在一定的基因交流,遗传多样性与地理来源有关。     

黄淮海地区夏玉米弯孢叶斑病菌遗传多样性分析

【目的】 针对黄淮海地区发生的玉米弯孢叶斑病,通过分子生物学技术,明确其致病菌新月弯孢（Curvularia lunata ）在不同地区和年份间的遗传差异及亲缘关系,为研究该病害的发生和流行提供数据资料。【方法】 对2013、2016和2017年采集自黄淮海地区5省（河南、河北、山东、安徽、江苏）的病样进行分离,并采用形态学和分子生物学（ITS和EF-1α 序列分析）对分离到的菌株进行鉴定,共获得175个新月弯孢菌株。从哥伦比亚大学开发的通用引物中筛选出13条多态性高、重复性好的引物,利用筛选出的引物对175个新月弯孢菌株进行ISSR-PCR扩增,利用Popgen32软件计算多态性比率、Shannon’s信息指数、群体间的遗传距离和遗传相似性,使用NTsys2.10e软件进行UPGMA聚类分析和基于遗传相似系数的主坐标分析,构建聚类分析图和散点图。【结果】 利用筛选出的引物对175个菌株进行PCR扩增,共获得105条多态性条带,多态性比率为100%。在群体平均水平上,基因多样性水平（H）为0.3867,Shannon’s的信息指数（I）为0.5682,表明玉米弯孢叶斑病菌具有丰富的遗传多样性;不同地理种群间的遗传多样性存在一定差异,河南和安徽种群遗传多样性最高,江苏种群较低;年度间相同地理来源的菌群亲缘关系较远,相同年份不同地理来源菌群亲缘关系较近。聚类分析显示所有菌株相似系数为0.51—0.93,在相似系数为0.59水平上,175个菌株被划分为2群5个亚群,亚群间表现出年度间的差异,不同地理种群病菌间存在基因交流,遗传相关性较高;主坐标分析结果与聚类分析结果一致,同一年份的菌株明显聚集在一起。【结论】 引起黄淮海地区玉米弯孢叶斑病的病原菌群体存在较高的遗传变异,地域相邻的病菌遗传关系较近;同一地区的菌株在年度间表现出一定遗传距离,而同一年份不同地理来源的菌株遗传距离较近。引起该地区玉米弯孢叶斑病的新月弯孢菌株不是以本地菌源为主,其主要菌源可能来自南方水稻和草坪草或东南亚玉米生产区,但也存在少量存活于地表病残体上的菌株可作翌年的初侵染源。     

黄淮海地区夏玉米灰斑病病原菌鉴定及主栽品种抗性分析

 为明确黄淮海夏玉米区玉米灰斑病的病原菌种类,于2017年从河北、河南、山东、安徽、天津五省市疑似发生玉米灰斑病的76个市县采集样本,采用组织分离法和显微单孢分离法获得病原菌,通过形态与分子生物学手段进行病原菌种类鉴定,并对黄淮海地区、陕西、辽宁、黑龙江的37个菌株进行ISSR聚类分析。结果表明,引起黄淮海地区玉米灰斑病的病原菌为玉蜀黍尾孢(Cercospora zeae-maydis),玉蜀黍尾孢的变异具有地理种群特征。同时对黄淮海夏玉米区主栽品种进行人工接种鉴定,结果显示6个主栽品种中郑单958、登海605、先玉335、浚单20等4个品种对玉米灰斑病抗性较差,玉米灰斑病在本区域具有大面积发生和流行的风险。本研究为黄淮海夏玉米区灰斑病的综合防控提供支撑和理论依据。     

黄淮海地区夏玉米灰斑病病原菌鉴定及主栽品种抗性分析

 为明确黄淮海夏玉米区玉米灰斑病的病原菌种类,于2017年从河北、河南、山东、安徽、天津五省市疑似发生玉米灰斑病的76个市县采集样本,采用组织分离法和显微单孢分离法获得病原菌,通过形态与分子生物学手段进行病原菌种类鉴定,并对黄淮海地区、陕西、辽宁、黑龙江的37个菌株进行ISSR聚类分析。结果表明,引起黄淮海地区玉米灰斑病的病原菌为玉蜀黍尾孢(Cercospora zeae-maydis),玉蜀黍尾孢的变异具有地理种群特征。同时对黄淮海夏玉米区主栽品种进行人工接种鉴定,结果显示6个主栽品种中郑单958、登海605、先玉335、浚单20等4个品种对玉米灰斑病抗性较差,玉米灰斑病在本区域具有大面积发生和流行的风险。本研究为黄淮海夏玉米区灰斑病的综合防控提供支撑和理论依据。     

海南三亚和黄淮海地区玉米小斑病菌致病性及遗传多样性分析

【目的】明确海南三亚玉米南繁基地和黄淮海玉米主产区的玉米小斑病菌（Bipolaria maydis）菌株的致病性差异,以及遗传多样性和亲缘关系的远近,为海南三亚南繁基地育种过程中玉米品种的抗病性筛选提供理论依据,并对玉米品种在黄淮海地区的推广种植提供参考。【方法】对采集自海南三亚和黄淮海地区的玉米小斑病病叶进行病原菌分离,经过形态学和分子生物学方法对分离到的菌株进行鉴定,共获得61株玉米小斑病菌菌株。采用人工喷雾接种法对61株小斑病菌菌株的致病力进行鉴定;并选取16条扩增条带清晰、重复性好、多态性高的引物进行ISSR-PCR扩增,利用Popgen32生物软件计算群体间的遗传距离和遗传相似性,并利用NTsys2.10e软件进行聚类分析,构建海南三亚与黄淮海地区小斑病菌的聚类图。【结果】致病性测定结果表明,海南三亚地区未分离到弱致病力菌株,强致病力菌株个数占三亚地区总菌株的57.1%;黄淮海地区分离到的弱致病力菌株占黄淮海地区总菌株的47.5%,强致病力菌株占黄淮海地区总菌株的17.5%。遗传多样性分析结果表明,在群体平均水平上,Nei’s基因多样性指数（H）为0.2820,Shannon’s信息指数（I）为0.4197,表明玉米小斑病菌具有一定的遗传变异;不同地理种群间的遗传相似系数为0.9028—0.9618,遗传距离为0.0390—0.1023,表明整体遗传相似系数较高,遗传距离较近;但不同地理种群间仍存在不同程度的遗传分化,其中,河南与河北的菌株群体遗传相似系数最高（GS=0.9618）,亲缘关系最近;河南和三亚地区的菌株群体遗传相似系数最低（GS=0.9028）,亲缘关系相对较远。聚类分析结果表明,三亚地区菌株和黄淮海地区菌株在相似系数为0.722时,明显被分为两大类群。【结论】黄淮海玉米主产区与海南三亚玉米南繁基地的玉米小斑病菌在致病力上存在一定差异,三亚地区强致病力菌株的分离频率高于黄淮海地区。黄淮海地区与三亚地区的菌株群体具有丰富的遗传多样性,且遗传多样性与地理来源有一定关系,地域相邻的菌株遗传关系较近;但三亚地区与黄淮海地区的菌株遗传相似系数相对较高,亲缘关系较近,且两种群间存在一定基因交流。因此,三亚地区作为玉米的南繁基地,其自然发病条件下筛选出对小斑病具有抗性的玉米品种或抗性亲本材料,对黄淮海地区小斑病抗性的逐年提高具有一定的影响,有利于减轻黄淮海地区病害的发生。     

新月弯孢变种的生物学特性及其对药剂的敏感性

为明确新月弯孢变种的发生和流行规律及有效防治方法，在不同碳源、氮源、温度、pH、光照等培养条件下，测定新月弯孢变种菌株HNWB-131、HNWB-185和模式菌株CX-3的生物学特性，并采用菌丝生长速率法测定这3株菌株对5种药剂的敏感性。结果表明，新月弯孢变种菌株HNWB-131和HNWB-185对碳、氮源的利用更敏感，在大部分碳、氮源培养基上其菌丝均为灰白色至黑色，与新月弯孢模式菌株的墨绿色存在明显区别；2株新月弯孢变种菌株的菌丝生长和产孢最适温度均为30℃，而新月弯孢模式菌株的菌丝生长和产孢最适温度分别为30℃和35℃；新月弯孢变种对光照条件更敏感，且黑暗条件对其分生孢子的产生和萌发有一定刺激作用；新月弯孢变种菌丝生长的最适pH为7~9，比新月弯孢模式菌株的最适pH范围窄（pH为5~11）。苯醚甲环唑对CX-3、HNWB-131、HNWB-185菌株的菌丝生长抑制作用最好，EC₅₀分别为0.39、0.58和0.52 μg/mL；其次为丙环唑，EC₅₀分别为0.79、1.97和1.64 μg/mL，表明2种新月弯孢变种对药剂的敏感性比模式菌株差。