水牛缝隙连接蛋白43基因克隆及表达

本研究克隆了水牛缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,对Cx43基因在水牛不同组织和不同发育阶段卵泡中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆获得了水牛Cx43基因序列,其中编码区全长1152 bp,编码383个氨基酸,蛋白质理论分子质量43.13 ku,等电点为8.88。多重序列比对结果显示,水牛Cx43核苷酸序列与牛、羊、猪、马和人相应序列的同源性分别为99%、98%、94%、93%和92%,系统进化树分析结果推测,Cx43基因在不同物种进化过程中具有高度保守性;对水牛Cx43蛋白的二级和三级结构分析发现,其具有缝隙连接蛋白的特有结构。定量RT-PCR结果显示,Cx43在水牛卵巢组织中相对表达量最高,睾丸、肾脏、心脏和皮肤次之,肝脏和大脑表达量较低。免疫组化结果发现,Cx43蛋白表达随卵泡发育时期的不同而变化,Cx43蛋白随卵泡发育表达逐渐增强。     

转人干扰素α-2b细胞株建立及其外源基因表达分析

[目的]从细胞水平探讨应用水牛乳腺生物反应器生产人干扰素α-2b(IFNα-2b)的可行性,为水牛乳腺生物反应器的制备提供参考依据.[方法]建立并优化核转染人乳腺癌细胞Bcap-37的方法,再利用该方法将水牛乳腺特异性表达人IFNα-2b载体导入Bcap-37细胞,建立转基因细胞株,然后分别从RNA水平和蛋白质水平对其能否正常表达人IFNα-2b进行分析.[结果]电压是影响Bcap-37细胞核转染效率的关键因素,对其进行优化(电压275 V、电击时间10 ms)后的核转染效率可达81.1％.使用优化后的核转染方法可将水牛乳腺特异性表达载体pBCN-IFN-CMV-EGFP-neo和pBCN-IFN-CMV-EGFP-IRES-neo成功转入Bcap-37细胞而获得转人IFNα-2b细胞株,经IFNα-2b基因的mRNA表达丰度及IFNα-2b蛋白的Western blotting检测,证实在两株转基因细胞系中均能顺利进行IFNα-26基因的转录与翻译.[结论]建立的核转染法能高效转染Bcap-37细胞,可应用该方法在细胞水平上对携带人IFNα-2b基因水牛乳腺特异性表达载体的表达能力进行分析,并证实乳腺特异性表达载体(pBCN-IFN-CMV-EGFP-neo和pBCN-IFN-CMV-EGFP-IRES-neo)均能用于水牛乳腺生物反应器的制备.     

水牛脑源性神经营养因子基因克隆、序列分析及其在不同组织中的表达研究

本研究克隆了水牛脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)基因序列,并运用生物信息学方法对序列的同源性、生物进化树、蛋白的理化性质及二、三级结构等进行了分析预测,同时利用QRT-PCR方法研究了BDNF mRNA在胎儿水牛及成年水牛不同组织中的表达情况。结果表明,应用RT-PCR技术克隆获得了长800bp水牛BDNF基因序列,其中编码区全长753bp,编码250个氨基酸。多重序列比对分析显示,水牛BDNF核苷酸序列与黄牛、野猪、犬、人、马、小鼠同源性分别为99%、94%、93%、90%、90%和89%;生物进化树分析显示,BDNF基因在不同物种进化过程中具有较高的保守性;BDNF蛋白理论分子质量28 173.36u,等电点9.12;蛋白二级结构由多个α-螺旋、β-折叠、T-转角及无规则卷曲组成,三级结构由多个α-螺旋、3对反向平行的β-折叠结构等构成活性中心(即NGF功能结构域)。QRT-PCR结果显示,BDNF mRNA在胎儿水牛及成年水牛的心脏、肺脏、肾脏、大脑、肌肉、卵巢、睾丸组织中都有表达,且成年水牛的表达量高于胎儿水牛。     

表儿茶素对小鼠卵母细胞mtDNA拷贝数和胚胎体外发育能力的影响

本研究旨在探究表儿茶素(epicatechin,EC)对小鼠体外成熟培养卵母细胞线粒体DNA(mtDNA)拷贝数及其随后孤雌激活胚胎发育能力的影响。小鼠卵丘-卵母细胞复合体(COCs)在添加不同浓度EC(0、5、10、15、20μmol/L)的成熟液中体外成熟培养16h后,采用实时荧光定量PCR的方法检测卵母细胞mtDNA拷贝数;同时,通过对卵母细胞进行孤雌激活处理,探讨其后续胚胎的体外发育能力。实时荧光定量PCR分析结果显示,添加EC各处理组的卵母细胞mtDNA拷贝数均有所增加,其中,10、15μmol/L组的mtDNA拷贝数均显著高于0μmol/L对照组(P0.05);但10μmol/L组mtDNA拷贝数更接近自然排卵周期合子的mtDNA含量(P0.05)。体外培养观察结果发现,成熟液中添加10μmol/L EC能提高卵母细胞第一极体排出率,与对照组相比差异不显著(P0.05),但能显著提高卵母细胞孤雌激活后胚胎的囊胚发育率(P0.05)。综上表明,小鼠卵母细胞体外成熟液中添加10μmol/L EC可提高卵母细胞的mtDNA拷贝数,有利于促进卵母细胞后续的发育能力。     

水牛水通道蛋白9基因克隆及其表达分析

本研究旨在对水牛水通道蛋白9 (aquaporins 9,AQP9) 基因进行克隆,并对其在水牛不同组织中的表达规律及其在水牛卵巢和睾丸组织中的表达差异进行探索。根据GenBank上黄牛AQP9基因序列(登录号:NM_001205833.1)设计特异性引物,以水牛睾丸组织cDNA为模板,应用RT-PCR方法扩增AQP9基因编码区片段;运用生物信息学方法分析其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质;应用实时荧光定量PCR技术分析AQP9基因在水牛组织中的表达情况;免疫组织化学方法分析AQP9蛋白在不同发育阶段水牛卵泡及睾丸组织中的表达差异。结果表明,克隆获得了888 bp的水牛AQP9基因编码区序列,其编码295个氨基酸。多重序列比较显示,水牛AQP9核苷酸序列与牛、猪、绵羊和人相应序列相似性分别为99%、90%、97%、88%;氨基酸序列的同源性分别为99%、86%、97%、83%,系统进化树分析结果推测,AQP9基因在物种进化过程中具有高度保守性。实时荧光定量PCR结果显示,AQP9基因在水牛肝脏、肺脏、大脑、皮肤、睾丸和卵巢组织中有不同程度的表达,在肝脏组织中表达最高,皮肤和睾丸次之,肺脏和卵巢表达较低。免疫组化结果显示,在卵巢组织中,AQP9蛋白表达随卵泡发育时期的不同而变化,并随着卵泡发育其表达逐渐增强;在睾丸组织中,AQP9蛋白在各级精母细胞和间质细胞中均有表达。结果提示,成功克隆得到水牛AQP9基因序列;AQP9在水牛卵巢和睾丸中的表达及其功能可能与水牛卵泡发育和精子发生有重要的关联。     

水牛水通道蛋白8基因克隆及表达分析

In this study, buffalo AQP8 gene was cloned and its eukaryotic expression vector was constructed, the expression pattern of AQP8 gene in buffalo ovary tissue was also assayed. The results showed that the CDS length of cloned buffalo AQP8 gene was 732 bp, and it shared 100% homology of amino acid sequence with cattle and mouse. AQP8 protein was detected in different developmental stages of buffalo follicles, it had significantly higher expression in the secondary follicles than that of in the primordial and the primary follicles (P＜0.05), and it mainly expressed in the granulosa cells of the secondary follicles. Clear EGFP green fluorescent was observed in transfected cell groups with transfection of the pEGFP-N1-AQP8 eukaryotic expression plasmid into HEK293T cells by Lipofectamine^R LTX and PLUS^TM reagent. The above results lay foundation to further investigate the function of AQP8 gene in the buffalo follicle development and granulosa cell apopotosis.