植酸酶基因的定点突变及其在巴斯德毕赤酵母表面展示

为解决植酸酶在制粒过程中易变性失活的问题,以黑曲霉(Aspergillus niger)ZJUY中的植酸酶基因phy A为亲本,借助聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)介导的定点突变,对植酸酶基因的关键位点进行密码子优化、引入氢键以及二硫键Cys196-Cys446的缺失突变;凭借无缝克隆成功将锚定片段FS和携带标签Flag的目的片段phy A插入酵母表达载体pPICZαC中;采用氯化锂转化法,将构建的8个表达载体pPICZαC-FS/phy A通过同源重组的方式整合到巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)GS115基因组上。细胞免疫荧光染色和流式细胞仪检测证实,基因改良后的植酸酶在巴斯德毕赤酵母细胞表面成功展示。重组菌株A31、A61和A84的植酸酶活性均可达7 000 U/g。与分泌型植酸酶相比,展示酶具有更好的高温和酸碱耐受性,其中菌株A61在90℃水浴处理1h后仍有18%的酶活,在pH 1.6~4.0范围内,残余酶活保持在80%以上。菌株A61这一特性可以克服制粒过程中(60~90℃)植酸酶变性失活的不足,能够较好地满足动物饲料用酶的需求。     

猪肺炎支原体SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速高效的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）检测方法,根据NCBI公布的Mhp保守序列设计4对特异性引物,依据4对引物的荧光定量PCR检测结果及拟合曲线进行相关性分析,筛选出最佳引物（SX4）,建立了Mhp SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法。该方法可特异性检测Mhp,对猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、副猪嗜血杆菌4型及链球菌2型等病原均无特异性扩增;最佳引物SX4检测的灵敏度可达4.9×101 copies/μL,组内和组间变异系数均小于2%。该方法可稳定检测出工艺生产抗原和市售疫苗中的Mhp菌量。试验表明,本研究成功建立了Mhp SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法,其特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于Mhp疫苗抗原生产和临床疫苗中的Mhp菌量检测。     

猪链球菌3型疫苗候选菌株筛选及3＋9型二价灭活疫苗对小鼠免疫效果评估

【目的】 筛选猪链球菌血清3型疫苗候选菌株,制备猪链球菌3＋9型二价灭活疫苗并评估其在BALB/c小鼠上的免疫保护效果。【方法】 从发病猪病料中分离猪链球菌血清3型菌株,通过蜡螟幼虫和BALB/c小鼠模型筛选出强毒株作为疫苗候选菌株,并对候选菌株进行生物学特性研究。将筛选得到的3型疫苗候选菌株和前期筛选的9型疫苗候选菌株灭活浓缩,使其抗原浓度为2×10¹⁰ CFU/mL,无菌检测后将浓缩抗原液按1：1配比混合,再混合抗原与Summit Poly Solution佐剂按4：1比例混合,制备猪链球菌3＋9型二价灭活疫苗,疫苗中猪链球菌血清3和9型含菌量均为2×10⁹ CFU/mL。将制备的疫苗免疫6周龄BALB/c小鼠,首免后第14天进行二免,二免后第14天进行攻毒。同时设立商品化疫苗免疫组和阴性对照组,评估疫苗的安全性和免疫保护效果。【结果】 PCR鉴定结果显示,23株临床分离株均为血清3型猪链球菌,依次命名为KQ3-1~KQ3-23。分别通过蜡螟和小鼠进行初筛和复筛,筛选到强毒株KQ3-1。毒力基因检测显示,该菌株基因型为gapdh^＋/sly^＋/fbps^-/orf2^-/mrp^-/89K^-/gdh^＋/epf^-;生长曲线显示,该菌株在37 ℃培养8~10 h时生长达到对数生长后期;BALB/c小鼠致病性结果显示,腹腔接种12 h内可引起小鼠精神萎靡、扎堆、毛发耸立、运动迟缓、死亡等临床症状,该菌株的LD₅₀为5.2×10⁷ CFU/只。制备的疫苗免疫小鼠后,小鼠精神状况、采食等均正常,疫苗注射部位无肿胀、硬块等不良反应,无死亡发生,表明该疫苗具有良好的安全性。免疫后进行猪链球菌血清2型菌株ZYS、猪链球菌血清3型菌株KQ3-1和猪链球菌血清9型菌株YT攻毒,对照组死亡率分别为90%、100%和100%,猪链球菌3＋9型二价灭活疫苗免疫组保护率分别为30%、80%和70%,商品化疫苗组的保护效果分别为70%、0和10%。【结论】 本研究研制的疫苗能对猪链球菌血清3和9型强毒株提供良好的免疫保护,该疫苗具备疫苗市场开发的潜在价值。     

微生物菌剂对重茬参地土壤性状的影响

为探索微生物菌剂对重茬参地的影响,本实验通过在重茬参地上施用续力保微生物菌剂和地养力微生物菌液来研究其土壤性状的变化。结果表明,施用微生物菌剂能够显著促进土壤中细菌和放线菌的增殖,抑制真菌数量的上升,并且能够显著降低参地土壤的EC值,使参地土壤性状得到一定程度的改善。