植酸酶基因的定点突变及其在巴斯德毕赤酵母表面展示

为解决植酸酶在制粒过程中易变性失活的问题,以黑曲霉(Aspergillus niger)ZJUY中的植酸酶基因phy A为亲本,借助聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)介导的定点突变,对植酸酶基因的关键位点进行密码子优化、引入氢键以及二硫键Cys196-Cys446的缺失突变;凭借无缝克隆成功将锚定片段FS和携带标签Flag的目的片段phy A插入酵母表达载体pPICZαC中;采用氯化锂转化法,将构建的8个表达载体pPICZαC-FS/phy A通过同源重组的方式整合到巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)GS115基因组上。细胞免疫荧光染色和流式细胞仪检测证实,基因改良后的植酸酶在巴斯德毕赤酵母细胞表面成功展示。重组菌株A31、A61和A84的植酸酶活性均可达7 000 U/g。与分泌型植酸酶相比,展示酶具有更好的高温和酸碱耐受性,其中菌株A61在90℃水浴处理1h后仍有18%的酶活,在pH 1.6~4.0范围内,残余酶活保持在80%以上。菌株A61这一特性可以克服制粒过程中(60~90℃)植酸酶变性失活的不足,能够较好地满足动物饲料用酶的需求。