梨花药愈伤组织诱导和悬浮培养体系的建立及应用

【目的】建立梨悬浮细胞体系，并利用悬浮细胞体系获得高质量悬浮细胞，进行遗传转化和原生质体的分离。【方法】以新梨7号花药为试材，诱导获得梨花药愈伤组织，研究了细胞悬浮系建立和影响悬浮细胞增殖的主要因子。【结果】花药在1/2 MS+1.0 mg·L^-12,4-D+0.4 mg·L^-1NAA+30 g·L^-1蔗糖+7 g·L^-1琼脂(pH值为5.8～6.0)培养基上诱导的愈伤组织，经4～5次继代得到了黄白色、颗粒状，状态相对较好的愈伤组织；将愈伤组织接种于液体培养基中，于28℃，200 r·min^-1的黑暗条件下悬浮振荡培养，经4～5次悬浮继代培养建立了悬浮细胞系，适宜的启动和增殖培养基为：MS+1.5 mg·L^-12,4-D+1.0 mg·L^-16-BA+30 g·L^-1蔗糖，细胞生长曲线呈“S”型，活细胞率达81.98%，近圆细胞率达83.66%，可作为遗传转化的受体，转化率为20.00%。也可直接用于原生质体的分...     

球等鞭金藻Δ5去饱和酶基因IgD5在拟南芥中的功能鉴定

从球等鞭金藻中克隆到一个Δ5去饱和酶基因, 命名为IgD5。系统发育树分析表明, 该基因编码产物与来源于巴夫藻Pavlova salina的Δ5去饱和酶亲缘关系最近。此前通过酿酒酵母表达系统, 证明IgD5对ω6脂肪酸具有Δ5去饱和酶活性, 但并未鉴定IgD5对ω3脂肪酸的催化活性。我们将IgD5转化能够内源合成二高-γ-亚麻酸(DGLA, 20:3Δ^8,11,14)和二十碳四烯酸(ETA, 20:4Δ^8,11,14,17)的已携带2个基因的拟南芥(简称TMA2), 通过PCR及RT-PCR筛选阳性植株, 提取转基因阳性植株叶片总脂肪酸, 用气相色谱分析法检测到花生四烯酸(AA, 20:4Δ^5,8,11,14)和二十碳五烯酸(EPA, 20:5Δ^5,8,11,14,17), 含量分别达7.44%和2.07%, 转化效率分别为68%和60%, 证明IgD5在转基因植物中具有Δ5去饱和酶的活性, 对ω3/ω6脂肪酸没有明显偏好性, 并且催化活性远高于其在酵母中的活性。在转IgD5的TMA2中除了AA和EPA, 没有检测到其他新脂肪酸, 表明IgD5底物专一性很强, 是一个可用于植物转基因替代生产鱼油的良好基因。     

玉米幼苗不同部位的再生能力和某些影响因子

为建立以玉米幼苗为外植体的高效再生体系, 克服幼胚取材的限制, 本研究选取萌发3 d的玉米幼苗作为供体材料, 研究其不同部位的再生能力。分别研究了种子萌发时的光照条件, N6培养基中Ca²⁺浓度, 及6个不同基因型对芽尖和根尖愈伤组织诱导率和分化率的影响。结果显示, 黑暗条件下萌发的幼苗, 其芽尖和根尖更适合作为外植体, 诱导培养基中添加终浓度为5 mmol L^-1的CaCl₂ 时的愈伤组织诱导率最高, 不同基因型的玉米愈伤组织的诱导率和分化率存在差异, 但影响趋势相同, 且同一基因型的不同外植体形成的愈伤组织形态相似, 分化率也相似。最后结论是黑暗条件下萌发3 d的齐319和鲁原92的幼苗, 可以代替玉米幼胚作为外植体用于组织培养研究。     

梨叶片原生质体制备方法的建立及其基因瞬时转化试验

以‘新梨7号’梨叶片为材料，探究影响原生质体分离的主要因素，制备高产优质的叶肉原生质体，并进行基因瞬时转化和表达。将继代30 d的组培苗嫩叶在最佳酶解液(1.0%纤维素酶，0.1%果胶酶，0.4%离析酶，0.5 mol·L^-1甘露醇，20 mmol·L^-1 KCl,20 mmol·L^-1 MES,10 mmol·L^-1 CaCl2,1.0 g·L^-1 BSA)中酶解12 h，可制备出产量为1.09×10⁶ protopl·mL^-1、活力为90%的原生质体。将1～2μg·mL^-1 pROK2-GFP质粒DNA通过40%PEG-4000介导转化至上述原生质体中并培养12 h，可以观察到GFP绿色荧光信号，转化率可达40%。     

玉米幼胚和源于幼苗的幼嫩叶段愈伤诱导及其植株再生的比较

 【目的】以育种上常用自交系的幼胚和源于幼苗的幼嫩叶段为外植体,研究它们在愈伤诱导及植株再生之间的区别与联系,为建立以叶段为外植体的另一高效稳定的玉米组培体系提供技术参考。【方法】选用6个育种上常用自交系,以幼胚和幼嫩叶段为外植体分别进行愈伤诱导及植株再生,研究2,4-D对不同外植体初级愈伤组织诱导的影响,对不同来源的6个自交系分别统计诱导率及分化率,并观察愈伤组织的形态。【结果】不同外植体对2,4-D浓度的要求不同,且幼嫩叶段相对幼胚较难诱导愈伤且需要的2,4-D浓度更高。同一基因型的幼胚和幼嫩叶段形成的愈伤形态基本无区别,不同基因型之间愈伤形态有差异。不同来源的6个基因型的愈伤诱导率、分化率也存在差异。【结论】通过再生过程中幼胚和叶段多方面的比较,筛选到3个诱导率较高且愈伤形态优良的基因型齐319、Mo17和鲁原92。     

源于玉米幼苗的幼嫩叶段愈伤诱导及其植株再生的研究

以6个不同基因型的玉米自交系幼嫩叶段为外植体,研究其愈伤诱导、继代和分化过程。结果表明,3mg/L 2,4-D是诱导叶段愈伤组织较为适宜的,玉米愈伤组织的诱导及分化与基因型有密切关系。从供试的6个基因型中筛选出出愈率较高、愈伤组织形态较好的3个基因型齐319、Mo17、鲁原92,对它们的愈伤组织进行GUS瞬时表达检测表明,来源于幼苗叶段的愈伤组织GUS+转化率较高。