一株感染深水网箱养殖许氏平鲉的病原菌分离与鉴定

2016年7月,山东省长岛县深水网箱养殖许氏平鲉(Sebastes schlegeli)暴发严重皮肤溃疡症。作者对病鱼进行病原菌分离。通过形态学观察、常规生理生化试验、gyrB和16S rDNA基因克隆测序等方法对分离菌株进行鉴定。在病灶溃疡处分离到一株绝对优势菌BZ01,该菌株在TSB固体培养基上呈半透明菌落,在TCBS选择性培养基上菌落呈绿色。透射电镜观察为短棒状,具有单根极生鞭毛。人工回接感染证明,该菌株对许氏平鲉具有较强的致病力,可以引起皮肤溃疡等症状,且与自然感染症状一致,其LD_(50)为2.07×10~6 CFU/ml。通过gyrB和16S rDNA基因序列测定并构建系统发育树显示,菌株BZ01与弧菌属同源性最高,并在系统发育树中与轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)聚为一枝,结合形态及生理生化表型测定结果,将该菌株鉴定为轮虫弧菌(V.rotiferianus)。药敏试验结果显示,该菌株对四环素类、喹诺酮类、香豆素类、肽酰转移酶类高度敏感,而对大环内酯类、多肽类、磺胺类、β-内酰胺类、氨基糖苷类中度敏感或不敏感。     

刺参响应灿烂弧菌侵染的基因组DNA甲基化水平和转录组差异及其关联分析

为探讨病原菌胁迫下刺参(Apostichopus japonicus)基因组DNA甲基化水平和转录组表达的差异,本研究采用人工攻毒侵染胁迫,获得刺参化皮体壁组织,并以未攻毒组的健康体壁组织为对照,对刺参2种体壁组织进行全基因组甲基化测序(WGBS)和转录组高通量测序,解析刺参体壁基因组DNA甲基化差异,筛选响应病原胁迫的差异甲基化区域和差异表达基因。同时,通过基因组甲基化和转录组联合分析,筛选负相关关联基因,为解析刺参响应灿烂弧菌(Vibrio splendidus)侵染的分子机理提供基础数据。结果显示,刺参对照组和侵染组基因组总甲基化水平分别为(3.59±0.04)%和(3.87±0.27)%,侵染组甲基化水平显著升高;在发生甲基化的位点中,攻毒组和对照组的mCpG占比分别为83.06%和81.91%,mCpG为最主要的甲基化形式。本研究共筛选出差异甲基化区域(DMRs) 626 677个,注释到23 706个功能基因。转录组测序共检测到29 290个基因,筛选到差异表达基因496个,其中,上调基因214个,下调基因282个。在基因组甲基化与转录组的关联分析中,筛选到180个负相关关联基因,其中,差异甲基化区域位于启动子区域的负相关基因为60个。对负相关关联基因的GO和KEGG富集分析,筛选到相关通路和LRR、hsp20和CARD等关键基因。本研究将为解析刺参抗病的表观遗传调控机制提供数据,也为刺参抗病性状选育提供科学参考。     

基于gyrB基因的SYBR Green I实时定量PCR检测病原灿烂弧菌

灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为62℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.338x+37.67,相关系数为0.999,扩增效率为0.99,最低能检测到20个拷贝。实验结果表明,该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对灿烂弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。     

刺参养殖池塘中新敌害生物澳洲异尾涡虫的鉴定及其危害

为了对导致辽宁大连、山东东营的2家养殖场池塘养殖刺参大量化皮死亡的新的敌害生物进行鉴定并确定其对养殖刺参的危害。本实验通过形态学观察、分子鉴定及系统发育分析确定了涡虫的分类地位,通过生态学方法确定了其生态适应条件,通过切割后培养的方法观测了其再生能力,通过与刺参苗种的共培养实验测试了该物种对刺参的危害及其危害方式。形态学观察结果显示,该涡虫体长0.96～3.26 mm,体宽0.49～1.93 mm,外观黄色或黄褐色,头部钝圆,具一对暗红色棒状眼点,尾部具两条并列的尾垂;显微镜镜检发现其表皮下分布密集的虫黄藻,体表周生纤毛,雌雄同体,口后具有两个生殖孔;对该物种COⅠ及18S r DNA基因片段扩增测序结果进行分析,并构建基于18S rDNA基因的系统发育树,结果显示该生物与澳洲异尾涡虫序列同源性达99.64%,根据其形态学特征,并结合18S rDNA分子鉴定结果,将该生物鉴定为澳洲异尾涡虫;进一步对其生活习性进行了研究,结果显示,该生物具有避光性,其适宜温度为18～24°C,适宜pH为5.5～8.0,适宜盐度为20～40;再生实验表明,该物种具有很强的前后轴极性再生能力;该生物与刺参的共培养实验表明,澳洲异尾涡虫对刺参体表表现出很强的趋向性,可以吸附在刺参体表导致刺参苗种溃疡、化皮甚至死亡,但刺参的体腔、肠道、呼吸树内均未发现虫体寄生。研究表明,澳洲异尾涡虫是营自由生活的池塘养殖刺参的一种新的敌害生物,在养殖过程中需要密切关注并防范该敌害生物。     

山东主要刺参养殖区幼参肠道抗生素耐药菌及耐药基因分布特征

为解析目前刺参(Apostichopus japonicus)苗种携带耐药菌及耐药基因现状，本研究从烟台、威海、青岛3个刺参主要养殖区的6家养殖场采集了幼参，对其肠道内容物中常用抗生素的耐药菌数量、占比和种类进行检测。利用荧光定量PCR技术，对样本中4类抗生素的7种耐药基因分布情况进行分析。结果显示，所检测的6个采样点中均有6种抗生素耐药菌的检出，从耐药菌占比来看，耐药菌占比最高的种类是乙酰甲喹、萘啶酸和四环素耐药菌，占比分别为0.05%~40.06%、2.16%~39.94%和0.06%~23.15%，氟苯尼考、庆大霉素和链霉素耐药菌的占比均不高，占比范围为0.01%~4.15%。由所分离到的98株耐药菌的鉴定结果可以看出，可培养的抗生素耐药菌分为4门5纲30属，主要集中在弧菌属、芽孢杆菌属和嗜冷杆菌属，占检出率的15.30%、13.27%和12.25%。基于属水平的不同抗生素耐药菌种类的分布统计结果显示，各采样点耐药菌种类差异较大，而且弧菌属、芽孢杆菌属和嗜冷杆菌属中均存在同一菌属中有耐多种抗生素的情况。对6个样本7种抗生素耐药基因的丰度检测结果显示，同一类抗生素的不同耐药基因的含量差异显著，除氨基糖苷类抗生素耐药基因aadA的相对拷贝数比例和链霉素以及庆大霉素耐药菌占比之间存在显著相关性(P<0.05)外，其他抗生素耐药基因的丰度与耐药菌占比之间相关性不显著(P>0.05)。研究表明，苗期刺参中存在一定的携带耐药菌和耐药基因的风险。     

过硫酸氢钾干预下对虾养殖系统中水质指标和菌群结构变化分析

摘要：该文通过水质理化因子监测、虾体和水体中可培养细菌和弧菌检测及高通量测序方法,系统解析过硫酸氢钾（PMS）干预下对虾养殖池塘水体环境指标和菌群结构的变化情况。结果表明：施用0.2 g/L PMS对对虾养殖水体中低含量氨氮也具有一定改善作用,泼洒PMS 24h和72h后的水温、溶解氧、pH、盐度、亚硝酸盐无显著差异。PMS泼洒后对虾肝胰腺内可培养细菌和弧菌数量分别由3.13×106 CFU/g和1.98×106 CFU/g降低至4.30×105 CFU/g和1.09×105 CFU/g,弧菌占比由63.36%降低至25.35%;水体中可培养细菌和弧菌数量分别由2.70×104 CFU/mL和6.00×103 CFU/m降低至8.50×103 CFU/mL和1.20×103 CFU/mL,弧菌占比由22.22%降低至14.11%,PMS可显著降低虾体和水体中可培养细菌数量及弧菌占比。对水体菌群结构进行高通量测序分析表明,放线菌门、拟杆菌门、蓝藻门和变形菌门为主要优势菌门,泼洒PMS前后（PB1/PA1）,腈基降解菌科、PeM15、DS001、Llumatobacteraceae、微杆菌科、红细菌科相对丰度显著升高（P<0.05）,巴纽尔斯菌科、腐螺菌科、Stappiaceae相对丰度显著降低（P<0.05）,对比泼洒PMS前后3天的变化趋势表明,泼洒PMS后池塘优势菌相对丰度发生显著变化且菌群结构PCoA指数偏离度较低。相关研究结果为评判PMS在水产养殖中的防控作用及其科学使用提供数据支撑。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)仔稚鱼发育期消化道可培养细菌的菌群特征分析

采用传统的细菌培养方法,对大菱鲆(Scophthalmus maximus)育苗生产过程中不同发育时期仔稚鱼的消化道、投喂饵料和养殖水源中的可培养细菌进行了菌群结构分析和优势菌株的16S rDNA同源性比较,揭示其形成过程和演替规律。结果显示,在大菱鲆仔稚鱼5?36日龄的不同发育时期,消化道中的细菌数量呈现了先升高后降低的变化趋势,在17?26日龄期间,仔稚鱼消化道可培养细菌数量级在105?106 CFU/g以上,并且与其他时期存在极显著差异(P<0.01)。弧菌总量呈现先升高后稳定的变化趋势,17日龄之前与之后存在显著差异(P<0.05)。至投喂颗粒饵料期,细菌总量和弧菌总量均稳定在104 CFU/g数量级,弧菌成为大菱鲆仔稚鱼消化道中的优势菌种。本研究发现,大菱鲆仔稚鱼发育早期消化道中的优势菌群变化明显,并且生物饵料中的细菌对消化道中的菌群结构影响较大,其中的Vibrio ichthyoenteri最终成为仔稚鱼消化道中的优势菌种。     

对虾肝胰腺坏死病副溶血弧菌双重微流控荧光定量PCR快速检测技术的建立与应用

急性肝胰腺坏死病(AHPND)是对虾养殖过程中最常见、最严重的疾病,给对虾养殖造成重大经济损失。AHPND病原种类多、基因型复杂,现有的针对不同病原的检测技术目标导向较弱、检测成本高、时间消耗长,对虾健康养殖亟待开发AHPND的精准快速诊断技术。本研究针对AHPND病原体携带编码一种二元毒素pirA和pirB大型质粒的遗传共性,基于pirA和pirB基因设计特异性引物并建立微流控荧光定量PCR检测方法。该方法对致病基因pirA和pirB特异性强、灵敏度高,最低检测限分别为5.43×100和4.31×101 copies/μL,样品平均检测时间为26 min左右。为进一步评估该方法在实际应用中的准确性,以含有pirA和pirB毒性质粒的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行人工感染实验。结果表明,感染后的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃丝、肝胰腺、肠道和肌肉等组织随时间的推迟均能检测到pirA和pirB;从感染2 h的结果来看,pirB比pirA检出率更高。此外,致病因子pirA和pirB比toxR的检出率更高,更适合对AHPND致病原的检测。本研究建立的微流控荧光定量PCR检测的方法具有快速、灵敏、高通量、污染少、现场检测、一体化集成等优点。该技术不仅适用于实验室,更符合养殖基层的现场快速检测需求,为及早认知疾病发生风险和病害精准防控提供了新的技术手段与理论支撑。     

5种主要海水养殖病原菌多重微流控荧光定量PCR快速检测技术的建立

在养殖现场开展多病原的快速检测是水产养殖产业健康发展的重要技术需求之一。本研究选取哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的vhhA基因、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的toxR基因、大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)的luxR基因、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)的empA基因和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. damselae)的Mcp基因作为靶基因,设计特异性引物,通过优化反应体系和条件,并在微流控芯片进行集成,建立了可同步检测这5种病原菌的多重微流控荧光定量PCR检测技术。结果显示,本研究所建立的检测技术最佳反应体系：2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 5 μL,Primer F/R各1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 1 μL。反应条件为95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,61 ℃ 30 s,扩增30个循环。通过绘制标准曲线发现,在109~104 copies/μL浓度范围内均有良好的线性相关性。该方法对哈维氏弧菌、副溶血弧菌、大菱鲆弧菌、鳗弧菌和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种特异性强,对5种病原菌的最低检测限分别为40、20、200、500和20 CFU/mL,显示出较高的灵敏度,且样品平均检测时间缩短至26 min左右。本研究结果为开发水产养殖多病原快速、精准的现场检测技术奠定了重要基础。     

黄连素对海水病原菌的杀灭效果及药效稳定性

为探讨黄连素对主要海水养殖病原菌的抑菌作用,采用二倍稀释法测定黄连素对迟缓爱德华氏菌、哈维氏弧菌等10种病原菌的最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度,并以美人鱼发光杆菌美人鱼亚种为指示菌,研究黄连素在不同温度、存储条件和金属离子影响下的药效稳定性。试验结果显示,黄连素对10种海水养殖病原菌均具有较好的抑菌及杀菌作用,最小抑菌质量浓度为64～256mg/L,最小杀菌质量浓度为256～1024mg/L。其中,黄连素对大菱鲆弧菌和溶藻弧菌抑菌作用最明显,最小抑菌质量浓度为64mg/L;对鳗弧菌、大菱鲆弧菌、迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌、鲨鱼弧菌和轮虫弧菌杀菌作用最强,最小杀菌质量浓度为256mg/L。质量浓度为512mg/L的黄连素溶液分别在20、40、60、80、100、121℃处理下作用30min,对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的杀菌率均超过99%,将20、60、100℃处理的黄连素溶液于室温下避光存储35d,对指示菌的杀菌率依然大于99%,显示其良好的药物稳定性。金属离子的影响试验也证实,水环境中的Na+、Mg~(2+)、Ca~(2+)、K~+等离子对黄连素的杀菌效果无显著影响。因此,黄连素适宜作为防治水产动物细菌性疾病的临床药物。