猪体外受精技术研究进展

猪体外受精是动物胚胎工程中的关键辅助生殖技术,利用屠宰场卵巢卵子资源,可实现优质胚胎规模化体外生产.结合胚胎移植和基因编辑技术,可生产出试管猪和基因编辑猪,科研和产业前景巨大.然而,与其他物种相比,猪体外受精技术方案还不完善,胚胎发育效率和质量仍旧低下,尤其是卵子多精子受精问题仍然没有得到解决.本文总结了卵母细胞成熟、...     

利用CRISPR/Cas9n技术生产抗蓝耳病的基因编辑克隆猪

本研究利用基于CRISPR/Cas9n系统的基因编辑技术结合体细胞核移植技术,构建了在同一载体中同时表达2条sg RNA和Cas9切刻酶以及绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的质粒,瞬时转染猪的成纤维细胞。通过流式细胞仪分选获得表达GFP的细胞,继续培养GFP阳性细胞至单个细胞长成细胞克隆点,经聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和DNA测序鉴定获得了对CD163基因进行编辑的细胞克隆点,阳性率高达90%(18/20)。以CD163基因编辑的细胞为供体细胞进行体细胞克隆和胚胎移植,获得了2头正常存活的CD163基因编辑猪。     

哺乳动物体细胞核移植胚胎发育中表观重编程的研究进展

体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）是一种能将已分化的体细胞重编程为全能胚胎的繁殖生物技术,在良种扩繁、濒危物种保护和治疗性克隆等方面有着广泛的应用前景,但极低的克隆效率、克隆动物胎盘异常、出生后胎儿畸形等严重限制了该技术的实际应用。造成克隆效率低和胚胎发育异常的主要原因是供体核表观遗传重编程错误或不完全。1958年,将非洲爪蟾（Xenopus laevis）幼体肠细胞核移入去核卵母细胞,获得了第1例SCNT动物个体;1986年,通过电融合1个卵裂球与去核卵母细胞成功获得了3只存活的羔羊;1997年,将成年母羊的乳腺上皮细胞与去核卵细胞电融合,获得首个SCNT哺乳动物"多利",开启了克隆时代,目前牛、小鼠、山羊、猪、欧洲盘羊、家兔、家猫、马、大鼠、骡子、狗、雪貂、狼、水牛、红鹿、单峰骆驼、食蟹猴等相继成功克隆,其中最引人瞩目的是2018年食蟹猴的成功克隆。作者通过将SCNT胚胎与受精胚胎的发育进行对比,阐述了SCNT过程中DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印迹、染色体状态等的重编程过程和缺陷,并从表观修饰剂、组蛋白去甲基化酶、抑制Xist表达、补充鱼精蛋白和精子RNA方面探讨单独或联合消除表观遗传重编程障碍对克隆效率的影响。随着低样本量测序技术的发展和完善,人们能够在SCNT胚胎中检测到更详细的全基因组表观遗传修饰图谱,进一步揭示SCNT胚胎表观遗传重编程中的缺陷,为提高克隆效率提供了线索。通过上述内容的阐述,希望为后续开发联合消除多种表观遗传障碍而提高克隆效率的策略和思路。     

Leptin对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活后早期胚胎发育的影响

为了探讨瘦素(Leptin)对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活后胚胎早期发育的影响,研究选择在Earle's盐缓冲的TCM199中添加10IU/mLeCG,10IU/mLhCG,10ng/mLEGF配制成化学限定的基础液,以添加不同浓度Leptin设定各试验组,对猪卵母细胞进行体外成熟培养。以未添加Leptin的基础液为对照组1,而添加5%的胎牛血清(FBS)、10%猪卵泡液为对照组2。比较分析各组卵母细胞核成熟效率,孤雌激活后胚胎的卵裂率,囊胚发育率。结果表明:各添加组卵母细胞成熟率与对照组之间无显著差异(P>0.05);孤雌激活后,各组间的卵裂率和囊胚发育率也无明显差异。同时,在化学限定的猪卵母细胞体外成熟液中添加Leptin对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活后早期胚胎的发育无显著效果。     

山羊p300基因生物信息学分析及其在主要器官中的表达

为探讨山羊p300基因的基因组特征及其在主要器官中的表达,本研究从染色体定位、基因结构、序列比对等方面对p300基因进行生物信息学分析,并通过实时定量PCR技术检测了p300基因在三月龄胎羊八种不同器官的表达情况。实验表明,p300基因定位于5号染色体,包含31个外显子,跨越长度63 766 bp,mRNA总长9 571 bp,CDS全长7 235 bp,编码2 411个氨基酸。p300在物种间保守性较高,其中山羊与绵羊同源性最高。此外,p300在山羊的8种器官中均有表达,且在心脏中相对表达量最高。     

METTL23基因在猪卵母细胞、早期胚胎和主要器官中的表达

METTL23是一种精氨酸甲基转移酶,通过表观遗传机制调控基因表达,在早期胚胎和器官生长发育方面发挥重要的调控作用。本实验借助在线数据库和基因分析软件对猪METTL23进行生物信息学分析,得知METTL23序列包含5个外显子,定位于12号染色体上,长度4 874 bp,mRNA全长2 501 bp,CDs全长573 bp,编码190个氨基酸。猪和羊之间METTL23同源性最高、亲缘关系最近。同时通过qRT-PCR技术,探究了METTL23在猪卵母细胞、早期胚胎以及心、肝、脾、肺、肾、睾丸和卵巢7种组织器官中的相对表达量。结果发现:MTEEL23在猪卵母细胞和早期胚胎中均有表达,其中生发泡期(Germinal Vesicle,GV)卵母细胞表达量最高,第二次减数分裂中期(Metaphase II,MII)卵母细胞和1-细胞胚胎时期表达量相似,但从1-细胞时期开始表达量逐渐下降,8-细胞时期降至最低,桑葚胚时期开始上升并持续到囊胚;METL23在猪各组织器官中的表达比较稳定,其中肝的表达量最高,其次依次为睾丸>肾>心>卵巢>脾>肺,且差异显著。本研究表明,METTL23在物种间的保守性较高,且在猪卵母细胞、早期胚胎和主要器官均有表达,METTL23可能在猪早期胚胎及组织器官发育过程中发挥重要作用。     

氧分压、培养基及微孔对小鼠胚胎体外发育的影响

通过小鼠(Mus musculus)胚胎体外培养,研究了培养基与不同氧分压环境之间是否存在偏好性;同时利用人体呼出的生理混合气体(肺气)对小鼠胚胎体外培养的可行性进行了探索;还比较了微孔(well of the well,WOW)培养法和成组培养法对胚胎发育的影响.结果表明:①在4%CO2+16%O2+78%N2+2%H2O(肺气)、5%CO2+5%O2+90%N2(5%O2,低氧)和5%CO2+20%O2+75%N2(20%O2,高氧)三种气相条件下,CZB和mKSOM两种培养基之间的胚胎卵裂率及囊胚率均差异不显著(P>0.05),但是,在肺气组中,CZB组的囊胚平均总细胞数明显高于mKSOM组(P<0.05);②低氧条件下,mKSOM组的囊胚率(22.6%)显著高于高氧和肺气条件下mKSOM组的囊胚率(P<0.05);③CZB培养基在低氧条件下获得的囊胚率与高氧或肺气条件下所获囊胚率差异不显著(P>0.05);④WOW培养法的囊胚发育率(74.6±5.1%)和囊胚平均总细胞数(76±2)显著高于成组培养法(分别为38.2±6.6%和58±4)(P<0.05).结果提示:培养基mKSOM和CZB在支持胚胎发育时对氧分压具有偏好性;肺气能有效支持胚胎的正常发育;WOW培养法有利于提高胚胎体外发育能力和囊胚质量.     

哺乳动物精子干燥冷冻保存技术研究进展

文章阐述了哺乳动物精子干燥冷冻保存技术的原理及研究意义,回顾了近期国内外哺乳动物精子干燥冷冻保存的重要研究成果,分析了精子来源、冷冻液、干燥压强与速率、保存温度与时间等因素对哺乳动物精子干燥冷冻效果的影响。文章还总结了评价精子干燥冷冻保存效果的若干指标,如用干燥冷冻的精子进行胞浆内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)、染色体完整率、卵母细胞激活率、囊胚形成率和移植后产仔率,展望了哺乳动物精子干燥冷冻保存技术应用前景,并指出了该技术存在的问题。     

新农科背景下信息化技术在高校农科教学中的应用

在新农科背景下,信息化技术对高等农科学校教学产生了极大的影响.高等农科教育在全球兴起的信息化时代下,对教师教学理念、模式和方法以及学生学习理念和方式均带来了许多的挑战和机遇.该文分析了信息化条件下高等农科教育教学的特点,提出信息化时代高等农科教育要求教师和学生改变教与学的理念,教师要因时提高备课能力和信息技术应用能力,适时调整教学模式,以适应信息化时代的要求,学生要提高学习能力,进而使高等农科教育教学发展能够与时俱进,满足新时代人才培养的需要.